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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽421001)

卒中是世界上常見死亡原因之一，并且是導(dǎo)致成人神經(jīng)功能損傷的重要原因。有近20%卒中是出血性卒中，而有80%的卒中是缺血性腦卒中[1]。研究表明卒中與癡呆[2]、老年人癲癇[3]以及老年人抑郁[4]的發(fā)生密切相關(guān)。

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，它是一種由一系列基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞成分自我消化的過程。自噬的功能是將細(xì)胞內(nèi)可溶性大分子物質(zhì)及衰老細(xì)胞器等轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解，實(shí)現(xiàn)其降解產(chǎn)物的再循環(huán)利用，從而參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持[5]。

已有研究表明，自噬參與腦缺血過程中。石瑤等[6]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過Sirtuins1通路促進(jìn)自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷，從而表明自噬在腦缺血中的激活是起保護(hù)性作用的。然而，耿武軍等[7]研究表明下調(diào)自噬能改善大鼠腦缺血再灌注損傷，提示自噬在腦缺血中可能起到損傷性作用。因此，目前自噬在腦缺血過程中的作用一直存在爭議。

N2a細(xì)胞是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立，細(xì)胞貼壁良好，多數(shù)成神經(jīng)元樣，具有軸突樣結(jié)構(gòu)，被廣泛用于神經(jīng)病理分子機(jī)制研究。且近年來N2a細(xì)胞的OGD模型被廣泛使用作為細(xì)胞水平模擬腦缺血的臨床過程[8-9]。本研究利用N2a細(xì)胞體外腦缺血模型來探討自噬在腦缺血過程中的作用，從而為后續(xù)研究自噬對腦缺血發(fā)生發(fā)展的影響以及相關(guān)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料N2a細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞中心實(shí)驗室饋贈。高糖DMEM、無糖DMEM、胎牛血清購于美國Gibco公司；RIPA Buffer、BCA protein Assay Kit及SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；兔多抗Beclin 1抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；兔多抗LC3B抗體、兔抗LAMP2、鼠單抗β-actin、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG以及3-MA購于美國Sigma公司；CCK8試劑盒/Cell Counting Kit-8為日本Dojindo公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購于中國南京建成生物工程研究所。

1.2儀器二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo scientific公司；多氣體細(xì)胞培養(yǎng)箱為日本SANYO公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為美國Bio Tek公司產(chǎn)品；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于美國BIO-RAD公司；倒置熒光顯微鏡購于日本Nikon公司；StepOnePlus實(shí)時熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1 N2a細(xì)胞培養(yǎng) N2a細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48～72 h傳代一次。

1.3.2 OGD模型的建立 N2a細(xì)胞OGD模型建立參照文獻(xiàn)[10-11]并加以改進(jìn)。選用生長良好的N2a細(xì)胞,置換成無糖無血清培養(yǎng)基后,置于37℃多氣體細(xì)胞培養(yǎng)箱(1%O2、5%CO2和94%N2)中分別培養(yǎng)1 h、4 h、8 h以及12 h,然后選擇最佳處理時間。

1.3.3 細(xì)胞生長曲線的測定 細(xì)胞增殖采用CCK8法來進(jìn)行測定。將N2a細(xì)胞以5×103個/孔的密度種植在96孔板中，將細(xì)胞分為Control、OGD 8h及OGD 12h組，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，經(jīng)過OGD處理后，棄原培養(yǎng)基，然后每孔加入90 μL新鮮高糖DMEM培養(yǎng)基及10 μL CCK8，37 ℃孵育1 h后在酶聯(lián)檢測儀上測定波長450 nm處的吸光度值。

1.3.4 細(xì)胞免疫熒光檢測 取生長良好的N2a細(xì)胞種植于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長融合到70%～80%左右，將N2a細(xì)胞分為Control、OGD 8 h及OGD 12 h組，經(jīng)過OGD處理后，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛注射液固定10 min后PBS再次清洗3次。然后利用0.5% Triton-X 100對細(xì)胞進(jìn)行透化處理5分鐘且用PBS清洗后，置入含5%BSA液體中室溫封閉30 min,加入1∶200稀釋的LC3抗體4 ℃孵育過夜。接下來PBS清洗3次，再加入1∶200稀釋的熒光二抗室溫避光孵育30 min，PBS再次清洗3次。最后加入DAPI染色10 min，PBS清洗且封片后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫印跡 將N2a細(xì)胞種植于6孔板中，待細(xì)胞生長融合到70%～80%左右，將細(xì)胞分為Control、OGD 8h及OGD 12h組，各組經(jīng)過相應(yīng)處理后，使用裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，每組各取20μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉處理1h，然后加入1∶200稀釋的Beclin 1、LAMP2，1∶500稀釋的LC3和1∶1 000稀釋的β-actin抗體4℃反應(yīng)過夜，TBST洗膜3次，再加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，顯影。將顯影所得的Beclin 1、LAMP2、LC3和β-actin條帶通過ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析后，計算Beclin 1、LAMP2、LC3相對蛋白表達(dá)量。本組實(shí)驗重復(fù)3次。

1.3.6 LDH釋放率的測定 本實(shí)驗分為Control組和3-MA組，OGD組和OGD+3-MA組，將N2a細(xì)胞分別種植于2塊6孔板中，將Control組及加入含5 mmol/L 3-MA細(xì)胞培養(yǎng)基的3-MA組置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將分別加入無糖培養(yǎng)基及含5 mmol/L 3-MA無糖培養(yǎng)基的OGD組及OGD+3-MA組置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h,然后收集上清及細(xì)胞裂解液，按南京建成檢測試劑盒說明書加入如下試劑及樣品：丙酮酸、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、雙蒸水、基質(zhì)緩沖液、輔酶I，混勻，37 ℃溫育15 min，加入2,4二硝基苯肼，混勻，37 ℃溫育15 min，再加入0.4 mmol/L碳酸氫鈉溶液，混勻，室溫放置5 min,波長450 nm,酶標(biāo)儀測定吸光度。按照所給計算公式分別計算出各組上清及細(xì)胞裂解液中LDH濃度。LDH釋放率=上清LDH濃度/(上清+細(xì)胞裂解液LDH濃度)，再分別以Control組和OGD組LDH釋放率為100%來計算3-MA組及OGD+3-MA組的相對LDH釋放率。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1免疫熒光檢測LC3在OGD處理后N2a細(xì)胞中的表達(dá)免疫熒光檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGD處理N2a細(xì)胞8 h及12 h后，LC3表達(dá)較對照組增高，且以O(shè)GD 8 h組LC3表達(dá)增高最顯著(圖1)。

圖1 免疫熒光檢測LC3在OGD處理后N2a細(xì)胞中的表達(dá)(400×)

2.2免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白在OGD處理后N2a細(xì)胞中的表達(dá)免疫印跡分析結(jié)果顯示,與對照組比較,OGD 8h組及OGD 12h組，LC3II/I蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05),Beclin 1與LAMP2蛋白表達(dá)量有增加趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)，(圖2，3)。

圖2 免疫印跡檢測LC3及Beclin 1在OGD處理后N2a細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 免疫印跡檢測LAMP2在OGD處理后N2a細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 CCK8法檢測OGD處理后N2a細(xì)胞活力將CCK8法檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示OGD處理后，N2a細(xì)胞活力較對照組明顯下降，且隨著OGD處理時間的延長，N2a細(xì)胞活力下降更加明顯(P<0.05)(圖4)。

圖4 CCK8法檢測OGD處理后N2a細(xì)胞活力

2.4 OGD處理對N2a細(xì)胞LDH釋放率的影響綜合上述實(shí)驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)N2a細(xì)胞經(jīng)過OGD 8 h處理后，自噬相關(guān)蛋白增加更為明顯，因此采用經(jīng)過OGD處理8 h的N2a細(xì)胞來檢測使用自噬抑制劑3-MA后N2a細(xì)胞LDH釋放率的變化。在未經(jīng)OGD處理的N2a細(xì)胞中，3-MA組的N2a細(xì)胞LDH釋放率相比對照組無明顯變化(圖5A)；而在經(jīng)過OGD處理的N2a細(xì)胞中，OGD+3-MA組N2a細(xì)胞的LDH釋放率相比OGD組降低(P>0.05)(圖5B)。

圖5 OGD處理對N2a細(xì)胞LDH釋放率的影響

3 討 論

自噬是指在自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,Atg)的調(diào)控下,細(xì)胞吞噬自身受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì),從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種溶酶體依賴的降解途徑[12]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與胰腺癌[13]、神經(jīng)退行性疾病[14-15]、心肌缺血再灌注損傷[16]、慢性阻塞性肺疾病[17]的發(fā)生與發(fā)展過程中。腦缺血性疾病是危害人類身體健康的重要疾病之一[18]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血過程中也有自噬參與。但對于自噬在腦缺血中是否激活以及自噬的作用，目前尚未有統(tǒng)一的結(jié)論。

為了探討自噬在腦缺血中是否激活，本研究采用N2a細(xì)胞OGD模型來模擬體外腦缺血過程。LC3分為LC3 I和LC3 II兩種蛋白形式，前者作為細(xì)胞質(zhì)性的LC3，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而后者作為膜型LC3則定位于自噬體膜上。因此LC3通常被作為自噬標(biāo)志物來檢測自噬活性[19]。研究中發(fā)現(xiàn)，N2a細(xì)胞經(jīng)過OGD處理以后，自噬標(biāo)記性蛋白LC3免疫熒光表達(dá)較對照組明顯增加，表明在OGD過程中，自噬活性增加。接下來，檢測了自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin 1蛋白表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGD 8h及12h后，N2a細(xì)胞LC3II/I比值顯著增加，而Beclin 1蛋白也有增加的趨勢，但尚未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與實(shí)驗樣本重復(fù)一致性欠佳，從而導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)未有陽性結(jié)果。但是，上述研究結(jié)果基本上證實(shí)OGD過程中自噬蛋白表達(dá)增加。

近幾年來越來越多研究者提出“自噬通量”的概念，認(rèn)為僅僅自噬相關(guān)蛋白如LC3、Beclin 1的表達(dá)增加，甚至電鏡下自噬體數(shù)目增加都不一定代表自噬活性增加，也有可能是因為自噬體數(shù)目增加，而溶酶體活性并沒有增加，導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白聚集而沒有得到有效的降解。自噬是自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，使自噬體內(nèi)包裹的物質(zhì)被有效降解的過程。LAMP2是一種定位于溶酶體膜上的重要溶酶體膜蛋白[20]，經(jīng)常被使用作為一種溶酶體的標(biāo)志物[21-22]。因此，進(jìn)一步檢測了LAMP2蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGD 8 h及12 h后，N2a細(xì)胞中LAMP2蛋白的表達(dá)較對照組盡管沒有顯著增加，但仍有增加趨勢。猜測可能與OGD處理時間點(diǎn)(OGD 8 h,OGD 12 h)有關(guān),可以適當(dāng)增加OGD處理時間點(diǎn)的范圍，從而找出最適宜的OGD處理時間，或者增加其他溶酶體標(biāo)志物如Cathepsin B來進(jìn)一步驗證溶酶體活性。綜合上述實(shí)驗結(jié)果，認(rèn)為OGD后自噬活性是增加的。

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，N2a細(xì)胞經(jīng)過OGD處理后細(xì)胞活性逐漸下降，且有顯著意義。而前一部分實(shí)驗也初步證實(shí)OGD后N2a細(xì)胞自噬活性增加，因此OGD后自噬活性的增加對N2a細(xì)胞是起損傷性作用的。3-MA是一種通過調(diào)節(jié)III型PI3K形成來阻斷自噬體的形成的自噬抑制劑[23-24]。為了進(jìn)一步證實(shí)本文的推測，使用3-MA抑制自噬，且通過檢測乳酸脫氫酶釋放率來進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)OGD處理的Control組與3-MA組兩組N2a細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放率無差異，而在OGD處理后，使用3-MA處理的N2a細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放率較OGD組下降。盡管差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但是后續(xù)試驗加大樣本量及增加重復(fù)次數(shù)可能獲得陽性結(jié)果。這部分結(jié)果提示3-MA可能減輕了OGD對N2a的細(xì)胞損傷。

總之，本實(shí)驗結(jié)果表明OGD后N2a細(xì)胞自噬途徑被激活，而自噬活性被3-MA抑制后減輕了OGD后N2a細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗?zāi)壳俺醪阶C實(shí)OGD誘導(dǎo)的自噬對N2a細(xì)胞是起損傷作用的，至于自噬的具體作用機(jī)制以及信號途徑，有待后續(xù)試驗進(jìn)一步探討。