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(1. 南華大學腫瘤研究所，湖南省腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2. 山東省鄒平縣人民醫(yī)院腫瘤科)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在我國每年發(fā)生率與死亡率分別為15.82%與17.70%，僅次于肺癌而位于第二，手術(shù)仍然是胃癌的唯一治療方法，而輔助化療與放療可以改善切除后的胃癌的預(yù)后[1-3]。破壞DNA的化療和放療可激活細胞檢查點功能，這些檢查點容易使DNA修復(fù)和促進未修復(fù)細胞死亡。大部分腫瘤抑癌基因與癌基因突變損傷細胞檢查點，而G1/S和G2/M期檢查點失活在細胞癌變過程中起著至關(guān)重要的作用。目前，已經(jīng)研發(fā)許多特異性抑制G2/M檢查點的化合物已成為腫瘤治療的新策略，其靶點是Chk1[4-6]。

本實驗室已經(jīng)證明，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)可抑制人胃癌細胞增殖和阻滯G2/M，與激活p38、抑制ERK/AP-1，上調(diào)組蛋白乙?；?、p21 WAF1等有關(guān)[7-9]。沉默Chk1可廢除胃癌BGC823細胞G2/M阻滯[10]。本研究建立穩(wěn)定高表達Chk1/2的BGC823細胞，為進一步研究Chk1/2功能奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人胃癌細胞株BGC823購自中國科學院上海細胞研究所。大腸桿菌 E. coli DH5α、真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1由本實驗室保存。RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒購自Promega公司；Taq Plus PCR Mastermix購自北京天根公司；BamHI和HindIII限制性內(nèi)切酶購自深圳晶美公司；質(zhì)粒小量抽提純化試劑盒和膠回收試劑盒購自江蘇碧云天公司；T4 DNA連接酶購自上海生工；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、G418、PRIM1640均購自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品；ECL發(fā)光劑LumiGLO Reagant為Cell Signaling Technology產(chǎn)品；Chk1與Chk2兔多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2引物合成Chk1與Chk2克隆引物分別由上海生工公司合成，根據(jù)GenBank中公布的人Chk1與Chk2 cDNA序列合成引物：Chk1：F5′-CGGAAGC TT ATGGCAGTGCCCTTTG-3′；R5′-CGGCGAAT TCTCATGTGGCAGGA-3′；Chk2：F5′-CGCCAGCTTATGTCTCGGGAG TC-3′；R5′-CGGAAT TCTCACAACACAGCAGCACAC-3′。引物5′端引入EcoRI酶切位點GAATTC，3′端引入HindIII酶切位點AAGCTT。

1.3總RNA的提取按照Omega公司RNA提取試劑盒說明書進行。

1.4 PCR擴增根據(jù)Promega公司cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，以提取的總RNA為模板在特異克隆引物下采用高保真DNA聚合酶擴增Chk1與Chk2全長cDNA片段。PCR擴增條件：Chk1：第一鏈cDNA產(chǎn)物2 μL，特異引物各1 μL，Taq Plus Mastermix 10 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，擴增29個循環(huán)。Chk2：第一鏈cDNA產(chǎn)物2 μL，特異引物各0.8 μL，Taq Plus Mastermix10 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 50 s，擴增30個循環(huán)。

1.5構(gòu)建真核表達載體將擴增的Chk1和Chk2 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1均用EcoR I和Hind III 雙酶切，并用瓊脂糖凝膠電泳回收純化。將目的片斷與載體用T4 DNA連接酶進行連接，構(gòu)建成重組真核表達載體pcDNA 3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2。重組載體用EcoR I和Hind III酶切鑒定和菌液PCR鑒定正確后，由上海生工進行測序鑒定，鑒定后大量擴增重組質(zhì)粒pcDNA 3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2。

1.6細胞轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)染前24 h按0.5×105cells/well將BGC823細胞接種于24孔板中，待細胞至90%～95%匯片。稀釋0.8 μg質(zhì)粒DNA于無血清Opti-MEM培養(yǎng)液中，總體積50 μL，輕輕混勻?；靹騆ipofectamineTM2000，取2 μL于無血清Opti-MEM培養(yǎng)液中至總體積50 μL混勻，室溫孵育5 min?；旌腺|(zhì)粒和LipofectamineTM2000，輕輕混勻，孵育205 min。將100 μL復(fù)合物加入24孔板，混勻。細胞于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h后換成10%小牛血清PRMI 1640完全培養(yǎng)基。24 h后細胞以1∶10比例傳代，48 h后加400 μg/mL G418篩選陽性細胞，3天換一次篩選培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 周，可見陽性細胞克隆。挑取單克隆細胞，培養(yǎng)后進行鑒定。

1.7 RT-PCR檢測分別提取轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1/Chk1、pcDNA3.1/Chk2與pcDNA 3.1質(zhì)粒的BGC823細胞和BGC823細胞總RNA，進行RT-PCR，具體反應(yīng)體系和條件同上，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.8 Western Blot檢測收集轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1/Chk1、pcDNA3.1/Chk2與pcDNA 3.1 質(zhì)粒的BGC823細胞，冰PBS洗2次，以1×106個細胞濃度加入細胞裂解液75 μL，冰上裂解20 min，采用BCA蛋白定量測定法檢測蛋白濃度，每一樣品取20 μg，以5∶1倍的體積與5×SDS加樣緩沖液混合，100 ℃加熱5 min，樣品經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉3 h，TBST洗膜3次，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入1∶2 000二抗室溫孵育30～60 min，ECL發(fā)光顯影，掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.9流式細胞儀測定收集轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1/Chk1、pcDNA3.1/Chk2與pcDNA 3.1的BGC823細胞于50 mL培養(yǎng)瓶中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，5 mL PBS洗2次，離心，去PBS，加入70%乙醇固定24 h，流式細胞儀分析DNA含量，檢測群體細胞中G1、S、G2/M期細胞百分率。

1.10統(tǒng)計學處理結(jié)果采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1真核表達載體pcDNA3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2的構(gòu)建提取約5×106人胃癌BGC823細胞的總RNA，圖1-A清晰可見28S和18S兩條，可用于下一步實驗。以cDNA為模板，PCR擴增，1%瓊脂糖電泳鑒定結(jié)果顯示，已分別擴增分子量為1400 bp和1600 bp左右的PCR產(chǎn)物帶，與測序推測值1431 bp和1632 bp相符(圖1-B)。對可能有Chk1和Chk2插入質(zhì)粒的DH5α受體菌行PCR擴增，電泳可見約1.4 kb和1.6 kb兩條帶，與預(yù)計大小一致。Chk1有3個陽性菌落，Chk2有8個陽性菌落(圖1-C)。取菌落PCR鑒定為陽性的克隆轉(zhuǎn)化菌，提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2，用BamHI、HindIII雙酶切，分別得到約6900 bp與1400 bp、6900 bp與1600 bp的兩條帶，結(jié)果與序列推測值一致(圖1-D)。序列經(jīng)NCBI Blast分析，Chk1序列同源性為100%，編碼氨基酸同源性為100%；Chk2序列同源性為99%，編碼氨基酸同源性為100%(圖1-E)。

圖1 真核表達載體pcDNA3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2的構(gòu)建A：人胃癌BGC823細胞總RNA電泳圖譜；B：pcDNA3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2 RCR擴增；C：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2陽性克隆菌落；D：重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；E：重組質(zhì)粒測序結(jié)果.

2.2建立高表達Chk1/2基因人胃癌BGC823細胞

2.2.1 BGC823細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 分別將空載體pcDNA3.1、pcDNA3.1/chk1與pcDNA3.1/chk2轉(zhuǎn)染BGC823細胞，經(jīng)400 μg/ml G418篩選2周后獲得陽性克隆(圖2-A)，隨機挑取陽性克隆作進一步鑒定。

2.2.2 Chk1和Chk2基因在BGC823細胞中的表達 提取BGC823細胞和轉(zhuǎn)染細胞總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S和18S條帶非常濃而亮(圖2-B)。RT-PCR與Western Blot顯示，空載體組Chk1和Chk2 mRNA與蛋白表達水平較對照組差異無顯著性(P>0.05)，而轉(zhuǎn)Chk1組和轉(zhuǎn)Chk2組Chk1和Chk2 mRNA與蛋白表達分別較對照組與空載體組明顯增加(P<0.05)(圖2-C，圖2-D)。表明轉(zhuǎn)染成功。

圖2 建立高表達Chk1/2基因人胃癌BGC823細胞A：G418篩選2周后陽性克隆(40×)；B：BGC823細胞和轉(zhuǎn)染細胞總RNA電泳圖譜；C：Chk1轉(zhuǎn)染細胞mRNA和蛋白表達；D：Chk2轉(zhuǎn)染細胞mRNA和蛋白表達.

2.2.3 流式細胞術(shù)檢測Chk1和Chk2高表達對BGC823細胞周期的影響 流式細胞術(shù)檢測顯示，Chk1 轉(zhuǎn)染組G2/M 細胞32.40%較對照組14.27%與空載體組14.97%明顯增加 (P<0.05)(表1)，而Chk2轉(zhuǎn)染組G2/M細胞19.37%較對照組14.17%與空載體組17.63%無明顯差異 (P>0.05)(表2)。表明調(diào)控BGC823細胞G2/M轉(zhuǎn)換可能主要是Chk1。

表1 Chk1高表達對BGC823細胞周期的影響(%)

與空載體組和BGC823組比較，aP<0.05

表2 Chk2高表達對BGC823細胞周期的影響(%)

3 討 論

DNA損傷信號的完整功能對保持基因組完整性和預(yù)防腫瘤發(fā)展至關(guān)重要。在對DNA損傷的反應(yīng)(DDR)中，檢查點可以被激活以阻止細胞周期的進展，直到損傷修復(fù)。在DNA損傷信號網(wǎng)絡(luò)中，監(jiān)視這些基因組途徑的中心是Chk1。它能促進細胞周期阻滯與DNA損害修復(fù)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和誘導細胞凋亡。Chk1直接磷酸化CDC25磷酸酶、P53、RAD51、FANCE和E2F等多個底物，調(diào)節(jié)其活性、穩(wěn)定性或亞細胞定位。Chk1的特征底物有助于細胞周期的阻滯和DNA修復(fù)，以應(yīng)對DNA損傷[5-6]。

目前主要使用的抗癌療法，要么直接破壞DNA，要么破壞細胞分裂。這些攻擊會觸發(fā)細胞周期檢查點的激活，保護細胞實現(xiàn)正確完成細胞周期階段的機制，修復(fù)損傷，或最終在無法修復(fù)的情況下自殺[11]。Chk1是在DDR過程中細胞周期檢查點的保守的蛋白激酶，激活對DDR或停止復(fù)制的蛋白激酶ATR是Chk1的唯一調(diào)控因子。Chk1的時空調(diào)節(jié)在DDR與正常細胞周期進程中很重要。Chk1通過基因毒性應(yīng)激來調(diào)節(jié)細胞周期檢查點，防止DNA損傷細胞進入有絲分裂，并協(xié)調(diào)DNA修復(fù)的各個方面[12]。近年來，運用細胞周期檢查點作為腫瘤治療的靶點，已經(jīng)成為研究的熱點，許多針對Chk1的強力抑制劑已經(jīng)發(fā)展成為抗癌藥物，其中一些抑制劑正在臨床試驗中[11-13]。

研究表明，pectenotoxin-2可通過增加ATM和Chk1/2磷酸化介導cdc25C磷酸化，下調(diào)cyclin B1與cdc2表達，明顯抑制乳腺癌細胞增殖和阻滯G2/M[14]。小分子Chk1抑制劑LY2603618可增加DNA 損傷介導Chk1 磷酸化，阻滯肺癌細胞于G2/M[15]。NSC746364通過激活A(yù)TR/Chk1通路、下調(diào)cyclin B1和激活caspase-3誘導人肺癌細胞G2/M期阻滯與凋亡[16]。近年來，發(fā)現(xiàn)不少中藥提取物可上調(diào)或活化Chk1誘導G2/M阻滯，如gossypin可活化Chk1磷酸化Cdc25C誘導惡性膠質(zhì)瘤U251細胞G2/M阻滯[17]。斑蝥素上調(diào)Chk1引起結(jié)直腸癌colo 205細胞G2/M阻滯[18]。鬼臼素的系列軛合物可激活腫瘤細胞ATM與Chk1，導致有效的DNA損害[19]。Scoulerine通過增加Chk1、Chk2和H3磷酸化誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯與抑制增殖[20]。

我們已經(jīng)證實，DADS可通過磷酸化ATR，激活Chkl與下調(diào)CDC25C和cyclin B1，阻滯胃癌MGC803細胞于G2/M[21]。沉默Chkl可消除DADS誘導BGC823細胞G2/M期阻滯，但沉默Chk2作用不明顯[6]。然而，闡明DADS阻滯人胃癌細胞G2/M阻滯的作用靶點是Chkl或Chk2，必須建立高表達Chkl/Chk2胃癌細胞。本研究采用基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1/Chk1與pcDNA3.1/Chk2，并轉(zhuǎn)染BGC823細胞，成功建立高表達Chkl/Chk2胃癌BGC823細胞，并且，Chk1高表達，而不是Chk2，可阻滯BGC823細胞于G2/M。但是，確定DADS阻滯人胃癌細胞G2/M阻滯的靶點是Chkl尚待進一步研究。