姚沛琳，蘇 博，徐禮生，張興桃，高貴珍

宿州學院生物與食品工程學院，宿州，234000

乳酸菌不僅具有抗癌抗衰老、降低膽固醇、增強機體免疫力、緩解乳糖不耐癥等功效，還能賦予發(fā)酵制品特殊的風味[1]，因此常用于發(fā)酵食品中?；罹退崮滔鄬τ诔厮崮?，不同點在于產(chǎn)品中有活菌的存在，而活菌的數(shù)量和菌株的性能是該類產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵[2]。根據(jù)我國相應的國家標準[3]，活菌型酸奶中的活菌必須達到一定數(shù)量才能在人體發(fā)揮功效，我國國家標準規(guī)定酸奶中活菌的含量應達到1×106cfu/mL?；钚匀樗峋仨氻樌ㄟ^復雜的人體消化系統(tǒng)和極端的胃腸道環(huán)境，才能在人體真正發(fā)揮益生作用[4]。

近年來，一些活菌型酸奶因獨特的口感和所宣傳的益生功效為人們所喜愛。研究表明，酸奶中使用的菌株多數(shù)具有較好的耐酸耐膽鹽性能和抗氧化能力[5-7]。在購買行為上，消費者更易受廣告宣傳的誘導。但并不是所有酸奶都具有所宣傳的效果，酸奶中添加的菌株是否能夠在人體發(fā)揮有益作用，有待進一步研究[8]。

為了探討活菌型酸奶中所含菌株能否在人體消化系統(tǒng)中存活以及是否具有抗氧化能力，本文以市售6種常見品牌旗下9款活菌性酸奶為研究對象，從中分離純化得到乳酸菌菌株，通過消除自由基等實驗分析菌株的抗氧化能力，通過耐酸耐膽鹽性實驗測定菌株對酸和膽鹽的耐受性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料與試劑：酸奶選自宿州市大潤發(fā)超市中售賣的6個品牌旗下9款酸奶(4 ℃下保存)：衛(wèi)崗風味酸奶、蒙牛優(yōu)益C、養(yǎng)樂多、君樂寶純享、伊利pureDay、蒙牛冠益乳、君樂寶每日活菌、伊利life up、光明暢優(yōu)；MRS肉湯培養(yǎng)基；二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、丙三醇、豬膽鹽、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸等，均為分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

儀器：LDZX-50KBS高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；WT-2ND超凈工作臺(北京玉堂藍翼科技有限公司)；SHP-400電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司)；721G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

根據(jù)文獻[9-11]中方法，將9款酸奶樣品分別進行10×梯度稀釋，選擇適宜的稀釋度，涂布于MRS固體平板上，培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。從平板上挑取單個形態(tài)不同的可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色并鏡檢，選擇G+菌且無芽孢的菌株在MRS瓊脂平板上多次劃線。挑取純化后的單菌落，將其接入MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)進行增菌，收集對數(shù)期的菌體，以甘油為保護劑，置于-40 ℃冷凍室內(nèi)進行菌種保藏。

1.2.2 菌株的抗氧化能力實驗

從保菌管中取出1 mL菌液置于MRS肉湯培養(yǎng)基中，連續(xù)活化3代，將活化好的菌液在8 000 r/min下離心15 min，收集上清液即為實驗所需發(fā)酵液。

1.2.2.1測定菌株的DPPH·自由基清除能力

結(jié)合文獻中方法[12-14]，并加以改進。取樣品2.0 mL，加入95%乙醇2.0 mL，混勻后再加入2.0 mL濃度為0.2 mmol/LDPPH溶液于試管中搖勻，避光放置60 min后，于3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，用95%乙醇作參比，測定其吸光度A1。同時把2 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液與2 mL的95%乙醇混合，以PBS緩沖液代替樣品，測其吸光度A2。把1 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基與2 mL的95%乙醇混合，再加入DPPH溶液，反應后在517 nm處測吸光度A3。

DPPH·自由基清除率用下式表示：

清除率=(A3-A1)/A2×100%

1.2.2.2 測定菌株的羥自由基(HO·)清除能力

結(jié)合文獻中方法[15]，并加以改進。將2 mL的6 mmol/L硫酸亞鐵溶液與2 mL的6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合后，加入2 mL的20 mmol/L的過氧化氫溶液進行反應，再加入2 mL樣品，37 ℃恒溫水浴1 h，于3 000 r/min下離心10 min。冷卻15 min后取上清液，在510 nm處測定吸光值A(chǔ)1。用雙蒸水取代樣品，測定吸光值A(chǔ)2，用MRS肉湯培養(yǎng)基取代樣品，測定吸光度A3。

HO·清除率用下式表示：

清除率=(A3-A1)/A2×100%

1.2.2.3 測定菌株的還原性

根據(jù)文獻中方法[16]，將1 mL樣品與1 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH7)混合，再加入1 mL的1%的鐵氰化鉀溶液。混勻后于50 ℃下水浴20 min，冷卻后加入2.0 mL的10%的三氯乙酸，4 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液，和2 mL的0.1%三氯化鐵溶液反應后，在700 nm處測吸光度。吸光度越高，說明反應混合物所對應的菌體的還原性越強，樣品的總抗氧化能力越高。

1.2.2.4 菌株耐酸性實驗

根據(jù)文獻中方法[17]，將活化好的菌株以2%的量分別接種于pH值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測定各組菌液的OD600值。

1.2.2.5 菌株的耐膽鹽實驗

根據(jù)文獻中方法[18]，將活化好的菌株以2%的量分別接種于豬膽鹽濃度為0，0.3，0.5，0.7 g/L的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測定各組菌液的OD600值。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌分離結(jié)果

使用加有指示劑溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基，挑選能使培養(yǎng)基顏色變黃的乳白色或乳黃色，邊緣齊整，表面凸起或扁平的典型單菌落[19]，同時過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性菌，初步確定從9款酸奶中分離出17種乳桿菌，其菌落形態(tài)及細胞特征如表1所示。

表1 乳酸菌菌落形態(tài)及細胞特征

2.2 菌株的抗氧化實驗結(jié)果

2.2.1 菌株的DPPH·自由基清除能力

DPPH·自由基是一種常見的穩(wěn)定的有機自由基，對人體器官具有極強的損害作用，常用于體外抗氧化實驗的研究。其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm處有強吸光性，當自由基清除劑加入DPPH溶液時，肉眼可見紫色變淺或消退，在517 nm處吸光性減弱[20]。本實驗通過這一特性檢測菌株的抗氧化能力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同菌株對DPPH·自由基的清除能力

由圖1可知，17株菌株對DPPH·自由基具有不同程度的清除能力，清除率均在25%以上。各菌株清除率相差較大，清除率最高的是分離自伊利PureDay 酸奶中的15號菌株，清除率高達39.86%。清除率最低的是分離自養(yǎng)樂多的4號菌株，清除率僅有28.02%。

2.2.2 菌株的HO·自由基清除能力

羥自由基具有很強的氧化性，對生物細胞大分子有較大的損害作用[21]。本實驗通過這一特性檢測菌株的抗氧化能力，結(jié)果如圖2所示。17株菌株對羥基自由基具有不同程度的清除率，清除率在37%～48%之間。各組菌株清除率相差不大，清除率最高的是分離自養(yǎng)樂多的4號菌株，清除率高達47.83%。清除能力最低的是分離自光明暢優(yōu)的14號菌株，清除率僅有37.68%。

圖2 不同菌株對HO·自由基的清除能力

2.2.3 菌株的還原能力

菌株的還原能力與其所含有的抗氧化劑息息相關(guān)，還原能力越強，清除自由基效率越高，抗氧化性就越強[21]。本實驗利用這一特性測定不同菌株的還原能力，所測的值為樣品稀釋2倍后的結(jié)果，如圖3所示。

由圖3可知，除1號與2號菌株還原能力相對較弱以外， 其他15種菌株的還原能力均較強，總抗氧化能力較強。

圖3 不同菌株的還原能力

2.2.4 菌株的耐酸性實驗結(jié)果

人體胃液的pH值約為2～3，在體外有較好益生作用的乳酸菌必須能順利通過胃液極端的酸性環(huán)境，才能在體內(nèi)發(fā)揮益生作用[4,22]。為了探討從酸奶中分離出的菌株的耐酸性，設(shè)立了pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7 6個不同的生長環(huán)境，37 ℃培養(yǎng)16 h后測定其吸光值，吸光值越高，證明菌株的耐酸性越強。結(jié)果如圖4所示。

圖4 耐酸實驗結(jié)果

由圖4可知，除4、7、10號菌株對酸性極為不耐受外，各菌株的最適pH值均為6。隨著pH值的降低，各菌株均減緩甚至停止生長。由此可得知，菌株在人體胃液環(huán)境下幾乎沒有活性。

2.2.5 菌株的耐膽鹽實驗結(jié)果

乳酸菌除了需要經(jīng)受人體極端的酸性環(huán)境的考驗，還需要經(jīng)受人體消化道的高膽鹽環(huán)境的考驗。為了探討從酸奶中分離出的菌株的耐膽鹽能力，設(shè)立了4個不同的膽鹽濃度，分別為0 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L和0.7 g/L，37 ℃培養(yǎng)16 h后測定其吸光值，吸光值越高，證明菌株的耐膽鹽能力越強。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在無膽鹽環(huán)境下各項菌株活性最大，隨著膽鹽濃度的增加，菌株活性逐漸減弱，在0.5 g/L和0.7 g/L膽鹽濃度下幾乎不生長。人體膽鹽濃度一般為0.3 g/L，除了4、7、10號菌株對膽鹽耐受能力較低外，其他各菌株對膽鹽的耐受性較好。

圖5 耐膽鹽實驗結(jié)果

3 結(jié) 語

酸奶屬于乳酸菌發(fā)酵型制品，乳酸菌菌株及其代謝產(chǎn)物可以促進腸道蠕動，改善人體消化功能，但乳酸菌能夠充分發(fā)揮益生作用的前提是可以大量、有活性地通過人體腸道[22-23]。由上述實驗結(jié)果可知，從市售酸奶中分離出的乳酸菌菌株，對酸性環(huán)境不耐受，即使是耐酸性較強的嗜酸乳桿菌，在pH2～3的條件下也幾乎不存在活性，在人體腸胃的酸性條件下不能很好地發(fā)揮作用。在耐膽鹽實驗中，絕大多數(shù)菌株表現(xiàn)出較好的耐膽鹽能力，對人體胃腸道中的膽鹽具有耐受性。

由抗氧化結(jié)果可知，菌株的DPPH·自由基清除能力、HO·自由基的清除能力和還原能力有較大差異，其中前兩項差別較大。同一株乳酸菌在三種不同的抗氧化實驗中進行測定，所得出的結(jié)果也不相同。可能是因為不同乳酸菌中抗氧化作用的活性物質(zhì)不同，同種乳酸菌對不同物質(zhì)的清除的機制不同。但總體來說，各菌株抗氧化能力均較強。

綜上所述，市售酸奶所選用的菌種總體性能良好，抗氧化能力與耐膽鹽性較強，但對酸性環(huán)境的耐受性不強，還需要進一步開發(fā)對酸性環(huán)境有較好耐受性的優(yōu)良菌株。