詹義鳳 薛敬玲 湯泉泉 張功學

(武漢大學基礎醫(yī)學院 武漢 430071)

大腸癌是多種致癌因素作用導致的惡性病變，在我國惡性腫瘤疾病中其發(fā)病率和病死率均居前5位[1]。據報道，隨著早期檢測和治療技術不斷發(fā)展，可提高大腸癌患者的存活率[2]，在提高大腸癌患者治療療效及改善預后方面均有著十分重要的意義，但目前尚缺乏敏感的實驗室指標。有研究認為，ULK1(unc-51 like kinase 1)自噬基因可能成為探討腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展、抑制腫瘤組織生長、克服腫瘤化療耐藥性研究的新作用靶點[3]。p53是抑癌基因，它參與細胞生長和轉錄調節(jié)，p53能與多種編碼調節(jié)自噬蛋白的基因啟動子結合，如AMPK和mTORC1的調控分子，自噬核心通路蛋白和溶酶體相關蛋白等[4]。近來研究表明，p53蛋白作為細胞核內一種促進自噬的轉錄因子，以依賴轉錄的方式參與自噬過程[5]。本實驗通過免疫組化方法檢測ULK1和突變型p53在大腸組織中的表達，探討其與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期等臨床病理因素的相關性，為臨床患者的臨床診斷及預后判斷提供有力的依據。目前尚無ULK1及p53同時在大腸癌及癌前病變中的表達及臨床意義的探討，本研究擬予以探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年7月～2017年6月在湖北省棗陽市第一人民醫(yī)院進行手術切除及活檢切除的組織標本，其中正常大腸黏膜組織，共20例，大腸腺瘤伴低級別上皮內瘤變組織、大腸腺瘤伴大腸高級別上皮內瘤變組織以及大腸癌組織，分別為30、30、40例。所有組織標本均已經病理組織學診斷證實。

1.2 研究方法

1.2.1試劑

兔抗人ULK1單克隆抗體購自武漢博士德生物生物技術有限公司，突變型p53單克隆抗體購自福州邁新生物技術公司，Maxvision3 Ultra DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術公司。

1.2.2檢測方法

各組組織學標本均采用10%甲醛溶液固定處理，常規(guī)予以石蠟包埋，3～4μm厚度連續(xù)組織切片。各組組織切片脫蠟至水，采用檸檬酸緩沖液高壓修復作用2min，滴加一抗溶液ULK1(工作濃度為1∶15)，p53溶液(即用型)在4℃溫度條件下過夜處理，然后滴加羊抗兔二抗溶液孵育30 min，DAB顯色作用5 min，然后予以蘇木素復染、脫水、透明及封片，以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，在光學顯微鏡下對組織切片予以判讀。

1.3 結果評估

由兩位有經驗的病理科醫(yī)生采用雙盲法分別獨立閱片。免疫組化結果主要根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度來判定。ULK1表達在細胞質，按染色強度：無染色為0分、淺黃色為1分、黃色為2分、深棕色(黃褐色，顏色偏深)為3分；按陽性細胞所占百分比：<5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。兩項評分相乘，乘積結果行最后評分：0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為(++)，>6分為(+++)。截斷點為3分，總分≤3分為陰性，>3分為陽性[6]。p53表達在細胞核：缺乏或弱染色1 分，中度染色2 分，強染色3 分；陽性細胞百分比：<10% 為1 分，10%～50%為2 分，>50% 為3 分。將染色和陽性細胞百分比2 項得分相乘，1～3分為p53 陰性，>3 分p53為陽性[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，率比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ULK1和p53在正常大腸組織、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變和大腸癌組織中的表達

圖1顯示，ULK1陽性染色為細胞質內出現棕黃色顆粒，p53陽性染色為細胞核出現棕黃色顆粒。表1所示，正常大腸組織、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變和大腸癌組織中，ULK1蛋白的陽性表達率分別為30%、53%、67%、78%，陽性表達率呈升高趨勢，4組之間ULK1蛋白陽性率表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；p53蛋白的陽性表達率分別0、7%、40%、63%，陽性表達率也呈升高趨勢，4組之間p53蛋白陽性率表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

ULK1p53正常大腸低級別上皮內瘤變高級別上皮內瘤變大腸癌

圖1 ULK1和p53在不同病理特征的大腸組織中的表達

表1 ULK1和p53在不同病理特征的大腸組織中陽性率表達情況

組別ULK1p53+陽性表達率(%)+陽性表達率(%)正常大腸組織(n=20)63000低級別上皮內瘤變(n=30)165327高級別上皮內瘤變(n=30)20671240大腸癌組織(n=40)31782563χ2值13.66535.636P值0.0030.000

2.2 大腸癌ULK1、p53表達與臨床病理特征的關系

表2顯示，ULK1、p53的陽性表達率與大腸癌的組織學分化、浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期有關；ULK、p53陽性率的表達，低分化腺癌組高于中-高分化腺癌組，浸潤深度深組高于浸潤淺組，有淋巴結轉移組高于無淋巴組，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組高于分期Ⅰ～Ⅱ期組(P<0.05)。大腸癌中ULK1、p53表達與腫瘤大小無關。

3 討論

細胞自噬是一種防御和應激調控機制。細胞通過細胞自噬和溶酶體，可及時清除和回收失活的蛋白分子和受到嚴重損傷的細胞器,為細胞的再生提供原料和能量。在腫瘤形成過程中，自噬可以作為抗癌機制發(fā)揮作用，它可以抑制ROS引起的損傷，并在DNA修復中發(fā)揮作用以及通過降解長壽蛋白質、缺陷細胞器控制細胞內穩(wěn)態(tài)，抑制腫瘤的發(fā)展，也可以讓腫瘤細胞耐受缺氧、饑餓、放療、化療等的刺激，甚至使腫瘤細胞長期存活[8]。在細胞內ULK1與Atg13、FIP200、Atg101等緊密結合形成的ULK1復合物位于自噬誘導的核心地位[9]。實驗證明干擾ULK1的表達就可以阻斷自噬的發(fā)生[10]。p53是一個抑癌基因，野生型p53參與對自噬的調節(jié)，這種調節(jié)依賴于p53蛋白在細胞內所處的部位，即核內的p53能促進自噬[11]，而胞質內的p53則抑制自噬[4]。p53通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依賴通路和非依賴 mTOR 通路[12]，參與自噬的調控。在哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依賴通路中mTORC1 直接與 ULK1 相互作用或使之磷酸化從而影響ULK復合體的形成[13]。野生型p53(WTp53)因為半衰期短，特別不穩(wěn)定，在細胞內的含量很低，免疫組化的方法根本無法檢測到，因此本實驗中的p53為突變型p53。本研究顯示ULK1和突變型p53在大腸各組標本中變化趨勢一致，那么突變型p53對ULK1是否起正向調節(jié)作用，還有待進一步研究。

表2 大腸癌ULK1、p53表達與臨床病理特征的關系

項目ULK1p53+陽性率(%)χ2值P值+陽性率(%)χ2值P值腫瘤大小≤5cm(n=22)1882>5cm(n=18)13720.5230.470156810560.6730.412分化程度中～高(n=24)1667低(n=16)15944.0380.044114614887.1110.008浸潤程度至或出漿膜(n=21)1991肌層(n=19)12634.2690.03917818426.4230.011淋巴轉移有(n=26)2389無(n=14)8575.1190.024218142910.5790.001TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(n=15)747Ⅲ～Ⅳ期(n=25)249613.0850.00074118785.7360.017

隨著大腸癌組織、高級別上皮內瘤變組織、低級別上皮內瘤變組織、正常結腸黏膜組織，本研究結果顯示ULK1，p53陽性率均明顯降低(P<0.05)，有研究表明ULK1蛋白在人類乳腺癌組織、外陰癌組織中表達水平較正常組織明顯下調[6,14]，這與本研究結果不一致。這可能與自噬的雙重調節(jié)機制有關[15]，一方面自噬可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；另一方面，一旦腫瘤形成后，自噬可以使癌細胞在應激的條件下存活。在大腸腺瘤癌變及早期大腸癌階段，突變型P53高表達，提示進展期腺瘤轉變?yōu)榇竽c癌過程中，突變型p53起了很重要的作用。突變型p53基因通過抑制野生型p53基因，使DNA 受損的細胞無受控的發(fā)生異型增殖，同時還直接或間接地抑制受p53基因上調表達的凋亡調控基因(PUMA)、p63、p73的促凋亡功能，促進大腸癌的發(fā)生。本研究P53的表達與王莉[16]等研究是一致的.大腸癌ULK1、P53表達在分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移TNM分期方面差異均有顯著性意義，結果提示ULK1、P53在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移中起重要的調控作用，并可作為相對獨立的參考指標進行檢測，臨床檢測ULK1、P53在大腸癌早期診斷、治療等方面具有重要的臨床應用價值。