哈斯其美格 陳麗華 肖朝虎

(西北民族大學(xué)實驗中心，蘭州 730030)

0 引 言

自順鉑作為抗癌藥物問世后，金屬配合物與DNA相互作用的研究一直是生物無機(jī)化學(xué)的重要課題[1-4]。最早用于治療癌癥和艾滋病的藥物是一些通過與DNA結(jié)合進(jìn)而干擾DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的藥物，且藥物與DNA的作用機(jī)制有利于藥物設(shè)計的靶向性[5]。因此，設(shè)計合成活性較高、毒副作用較低的抗腫瘤藥物分子，關(guān)鍵在于研究藥物分子與DNA的相互作用。通過研究藥物分子與DNA相互作用，有利于了解藥物作用機(jī)理，進(jìn)行藥物體外篩選，以及利用藥物構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行藥物結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計活性更高、毒副作用更低的新藥物分子。

卟啉及金屬卟啉類化合物是一種重要而特殊的物質(zhì)，具有獨(dú)特的生物活性。如光合作用中的關(guān)鍵物質(zhì)葉綠素(含鎂的卟啉化合物)、促進(jìn)骨髓造血的血紅素(含鐵的卟啉化合物)等都廣泛存在于自然界和生物體中[6]。近年來，卟啉類化合物因其結(jié)構(gòu)的特異性，被廣泛的應(yīng)用于各個領(lǐng)域如醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、材料化學(xué)等，尤其是其醫(yī)學(xué)方面的研究已成為當(dāng)今的熱門課題，涉及的領(lǐng)域包括如研發(fā)抗病毒試劑、DNA/RNA選擇性切割試劑、端鏈酶抑制劑及研究DNA足跡法、DNA/RNA雜交的穩(wěn)定等[7-9]；又如利用其光敏性、實現(xiàn)光動學(xué)治療或利用其對腫瘤細(xì)胞的特殊親和性和選擇性富集的特點，實現(xiàn)抗腫瘤作用等[10-13]。但由于卟啉化合物具有較大的剛性空間構(gòu)型，其在水中的溶解度幾乎為零，這大大限制了卟啉化合物在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。而吡啶基、磺酸基、氨基、羧基等大極性基團(tuán)具有良好的水溶性，可以通過將卟啉環(huán)與大極性基團(tuán)結(jié)合在一起，獲得相應(yīng)的水溶性卟啉及金屬卟啉[14-17]。水溶性卟啉及金屬卟啉被認(rèn)為是具有“雙重作用”的化合物，其原因在于水溶性卟啉化合物一方面能與帶有負(fù)電荷的水溶性DNA穩(wěn)定結(jié)合，另一方面可利用其光活性裂解DNA。因此，對水溶性卟啉及金屬卟啉與DNA相互作用及其抗腫瘤活性的研究，將有助于更深入了解DNA的結(jié)構(gòu)和功能，有助于水溶性卟啉及金屬卟啉在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，如PDT、癌癥檢測、人造核酸酶、抑制病毒等[18-20]；對認(rèn)識很多疾病的治療機(jī)制和藥物的設(shè)計也起到非常重要的作用。

本文合成了3種A3B型水溶性含溴銅卟啉(CuP-1)及其溴取代衍生物(CuP-2、CuP-3)，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。采用紫外光譜法、EB-DNA熒光淬滅法、粘度法以及圓二色譜法等光譜手段研究了它們與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用。采用噻唑蘭(MTT)法，以人成纖維細(xì)胞為正常細(xì)胞系，評價了CuP-1、CuP-2和CuP-3在不同濃度、不同作用時間下，對宮頸癌細(xì)胞(Hela)和乳腺癌細(xì)胞(MDA)2種腫瘤細(xì)胞株的抗腫瘤活性。以期為研究和開發(fā)療效更高、毒副作用小的具有抗腫瘤活性的卟啉類藥物提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所用試劑均為分析純，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)使用前用CaH2回流除水，然后減壓蒸餾備用。吡咯使用前重蒸。除非另有說明，其余試劑在使用前均不做任何處理。CT-DNA購自Sigma公司，溴化乙錠(EB)，三羥甲基甲胺(Tris)等均購自上海生工生物工程公司。胎牛血清購自GIBCO公司，DEME購自Hyclone公司。

儀器包括核磁共振儀 (MERCRY Plus 400)、質(zhì)譜儀(Bruker Esquire 6000)、紫外光譜儀(UV-2550)、熒光光譜儀(RF-5301PC)、粘度計(UbbeloMe)、圓二色譜儀(J-810)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標(biāo)儀(THERMO MultisKan FC)等。

1.2 合成及表征

1.2.1 5，10，15-三(4-吡啶)-20-(4-對溴)苯基卟啉的合成

稱取1.85 g(0.01mol)對溴苯甲醛于500 mL三口燒瓶中，加入150mL丙酸，加熱并攪拌。當(dāng)油浴溫度達(dá)到130℃左右時，快速加入2.7mL(0.03mol)4-吡啶甲醛，再用滴液漏斗緩慢滴加溶解在10mL丙酸中的新蒸吡咯2.6 mL(0.04 mol)，10 min內(nèi)加完。溶液逐漸變?yōu)樽睾谏?，保持高速攪拌?40℃繼續(xù)回流2 h。反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸餾，蒸去丙酸，得到深紫色的粗產(chǎn)物。將深紫色粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷中，用飽和碳酸氫鈉中和，有機(jī)相以無水硫酸鈉干燥，濃縮。用硅膠(200～300目)作固定相，二氯甲烷和石油醚混合液(1∶1，V/V)作流動相，不同體積比的二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液做洗脫劑進(jìn)行柱層析分離純化，收集第 5色帶，減壓旋蒸，真空干燥，即得紫色目標(biāo)產(chǎn)物 5，10，15-三(4-吡啶)-20-(4-對溴)苯基卟啉，產(chǎn)率：4%。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.99(d，6H)，8.79～8.60(m，8H)，8.19(m，6H)，8.07(m，2H)，7.83(d，2H),-3.00(s,2H)。質(zhì)譜 m/z：698.331 0,[M+H]+。 元素 分 析 按 C41H26BrN7計 算 值 (%)：C，70.69% ；H，3.76%；N，14.08%。 實驗值(%)：C，70.63%；H，3.78%；N，13.98%。

1.2.2 CuP-1的合成

稱取 100mg(0.14mmol)5，10，15-三(4-吡啶)-20-(4-對溴)苯基卟啉于50mL三口燒瓶中，加入5 mL無水DMF，磁力攪拌使其溶解。氬氣保護(hù)、避光的條件下，將1 mL碘甲烷(過量)加到上述溶液中，繼續(xù)避光、通氮?dú)猓?0℃加熱攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)完畢停止加熱，冷卻至室溫，緩慢滴加丙酮，析出沉淀、過濾，濾餅反復(fù)用三氯甲烷洗滌、真空干燥，得到5，10，15-三甲基吡啶基-20-(4-對溴)苯基卟啉，產(chǎn)率：89%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ9.51(s，6H)，9.01(m，12H)，8.09(m，2H)，7.83(d，2H)，4.59(s，8H)，-3.00(s，2H)。 質(zhì)譜 m/z：742.060 7，[M-3I]+。元素分析按C44H35BrI3N7計 算 值 (%)：C，47.08% ；H，3.14% ；N，8.74%。實驗值(%)：C，47.05%；H，3.16%；N，8.75%。

稱取 100 mg(0.13 mmol)5，10，15-三甲基吡啶基-20-(4-對溴)苯基卟啉溶于5 mL無水DMF中，加入3 mL溶有89 mg(0.52 mmol)氯化銅的無水甲醇溶液，65℃攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸去甲醇，滴加丙酮，析出沉淀、過濾，濾餅反復(fù)用三氯甲烷洗滌、真空干燥,得到目標(biāo)產(chǎn)物CuP-1，產(chǎn)率：75%。1H NMR(600 MHz，DMSO) δ9.32(m，6H)，8.09(m，6H)，7.27～7.55(m，4H)，6.68(d，2H)，4.50(s，5H)，3.56(s，9H)。ESI-MS：質(zhì)譜 m/z：803.033 4，[M-3Cl]+。 元素分析 按 C44H33BrCl3CuN7計 算 值 (%)：C，58.10% ；H，3.66%；N，10.78%。 實驗值(%)：C，58.03%；H，3.70%；N，10.88%。UV-Vis(Tris-HCl buffer，pH=7.2)λmax/nm(absorbance)=424.5(1.579)，549.5(0.198)，584(0.09)。

圖1 CuP-1、CuP-2及CuP-3的合成路線Fig.1 Synthesis routes for CuP-1,CuP-2 and CuP-3

1.2.3 CuP-2或CuP-3的合成

氬氣保護(hù)下，將100 mg(0.13 mmol)CuP-1溶于30mL無水DMF中，依次加入33mg(0.2mmol)咔唑或 29 mg(0.2 mmol)2-(咪唑-2-基)吡啶，84 mg(0.26 mmol)碳酸銫，5 mg(0.026 mmol)碘化亞銅和5.5 mg(0.13mmol)無水氯化鋰，于140℃回流反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，滴加三氯甲烷，析出沉淀、過濾，濾餅反復(fù)用三氯甲烷洗滌、真空干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物 CuP-2或 CuP-3，產(chǎn)率：43%(CuP-2)或 37%(CuP-3)。

CuP-2：1H NMR(600MHz，DMSO)δ9.12(m，6H)，8.30(m，6H)，8.06 ～7.10(m，6H)，4.49(s，6H)，3.30(s，9H)。 質(zhì)譜 m/z：888.293 6，[M-3Cl]+。 元素分析按C56H41Cl3CuN8計算值 (%)：C，67.54%；H，4.15%；N，11.25%。實驗值(%)：C,67.61%；H，4.09%；N，11.23%。UV-Vis(Tris-HCl buffer，pH=7.2)λmax/nm(absorbance)=422.5(1.491)，546.5(0.182)，628.5(0.12)。

CuP-3：1H NMR(600MHz，DMSO)δ9.18(m，6H)，8.30(m，6H)，7.93(s，3H)，4.49(s，6H)，3.30(s，9H)。質(zhì)譜m/z:866.124 4,[M-3Cl]+。元素分析按C52H40Cl3CuN10計算值(%)：C，64.07%；H，4.14%；N，14.37%。 實驗值(%)：C，64.09%；H，4.13%；N，14.36%。 UV-Vis(Tris-HCl buffer,pH=7.2)λmax/nm(absorbance)=433.5(1.405),564.5(0.108)，628.5(0.076)。

1.3 配合物與DNA相互作用的實驗

CT-DNA 溶液用緩沖溶液(5 mmol·L-1Tri-HCl，50 mmol·L-1NaCl，pH=7.2)配制，測其 A260/A280=1.8～1.9，說明該DNA溶液基本上不含蛋白質(zhì)[21]，不需要進(jìn)一步處理。CT-DNA的濃度根據(jù)其在260 nm處的摩爾消光系數(shù)值(6 600 L·mol-1·cm-1)來計算[22]。 配合物的溶液用稱量法進(jìn)行配制。

1.3.1 紫外光譜滴定實驗

室溫下，參比池中加入3.0 mL Tris-HCl(pH=7.20)緩沖溶液，樣品池中加入3.0 mL待測樣品，用微量進(jìn)樣器每隔5 min向樣品池中加入2μL 1.0 mmol CT-DNA并攪拌，直到紫外吸收值恒定不變。每次加CT-DNA前檢測其在200～700 nm范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜。待測樣品與CT-DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)(Kb)由下面公式計算得到：

其中，εa代表存在不同濃度的CT-DNA時待測樣品的摩爾消光系數(shù)；εf為不存在CT-DNA時待測樣品的摩爾消光系數(shù)；εb為待測樣品與CT-DNA作用達(dá)到平衡時的摩爾消光系數(shù)。以cDNA/(εa-εf)為縱坐標(biāo)，cDNA為橫坐標(biāo)作圖，得到一條直線，待測樣品的結(jié)合常數(shù)(Kb)即為這條直線斜率與截距的比值。

1.3.2 EB-DNA淬滅實驗

恒定室溫下，熒光池中加入2.5mL Tris-HCl緩沖溶液和20μL EB，然后滴加4μmol·L-1CT-DNA直到熒光強(qiáng)度不再變化即達(dá)到滴定平衡(λex=496 nm，λem=596 nm)。每隔5 min，用微量進(jìn)樣器滴加0.2 mL待測樣品直到熒光強(qiáng)度不再下降即達(dá)到滴定平衡。根據(jù)Stern-Volmer方程[23]計算熒光淬滅常數(shù)(Ksv)：

其中，F(xiàn)0代表不存在待測樣品時的熒光強(qiáng)度；F代表存在待測樣品時的熒光強(qiáng)度；cQ代表淬滅劑的濃度；Ksv代表動態(tài)淬滅常數(shù)。

1.3.3 粘度實驗

在(25.00±0.01)℃恒定溫度條件下，首先將10 mL Tris-HCl(pH=7.20)緩沖溶液加入到粘度計中，測量溶液流經(jīng)毛細(xì)管所用的時間為t0；接著將50μL配制的CT-DNA溶液加入其中，混勻后，測量溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間t；每隔5 min，滴加待測樣品2.5μL，混勻后，測量待測樣品加入后CT-DNA粘度的變化；停止測量，直至流動時間基本不發(fā)生變化。此操作重復(fù) 3 次。以(η/η0)1/3為縱坐標(biāo)，待測樣品與CT-DNA濃度比為橫坐標(biāo)作圖，觀察CT-DNA相對粘度變化[24]。

其中η0代表不存在待測樣品時CT-DNA粘度值，η代表存在待測樣品時CT-DNA粘度值。

1.3.4 圓二色譜實驗

首先將1 mL Tris-HCl(pH=7.20)緩沖液加到比色池中，掃描其在220～500 nm范圍內(nèi)的CD光譜作為對照，然后將 10μmol·L-1待測樣品和50μmol·L-1CT-DNA溶液混合，混勻、反應(yīng) 5 min，在 220～500 nm范圍內(nèi)測定待測樣品的ICD光譜。

1.4 抗腫瘤活性實驗

人成纖維細(xì)胞(L929)、宮頸癌細(xì)胞(Hela)和乳腺癌細(xì)胞(MDA)均由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。取宮頸癌細(xì)胞 (Hela)、乳腺癌細(xì)胞(MDA)和人成纖維細(xì)胞(L929)(處于對數(shù)生長期)，用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)配制單細(xì)胞懸浮液，濃度約為4×104mL-1。然后接種于96孔板中。每孔加入的細(xì)胞懸液為100μL，需要注意的是配制單細(xì)胞懸液時盡量保持加入每孔的細(xì)胞數(shù)一致。

將細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁再分組，分為4組進(jìn)行實驗，對照組(con)為不加藥組，加入DMEM培養(yǎng)基(含有10% 胎牛血清 )；其余各組為實驗組(exp)，各實驗組分別加入100μL的含CuP-1～CuP-3的濃度分別為 25、50、75 及 100 μmol·L-1的溶液。 每組設(shè) 3個實驗孔、3個復(fù)孔。37℃、5%(V/V)CO2，水蒸氣飽和培養(yǎng)條件下，分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48和72 h，以僅含有10%胎牛血清DEME培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞的空白組為調(diào)零孔。

培養(yǎng)終止，分別向每孔中加入10μLMTT溶液(5 mg·mL-1)，原條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)終止后，棄上清液，加二甲基亞砜(DMSO)(200μL)到每孔，然后以中速于水平搖床上振蕩15min，檢測570 nm吸光度OD值。重復(fù)3次實驗，計算細(xì)胞抑制率(Rin)公式如下：

其中ODexp為實驗組OD值，ODcon為對照組OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜滴定實驗

卟啉類化合物的結(jié)構(gòu)中由于存在共軛大環(huán)結(jié)構(gòu)，而具有紫外可見吸收特征光譜，在Soret帶有一個強(qiáng)吸收峰而在Q帶有3～4個弱的吸收峰[25]。因此紫外-可見光譜常被用來研究卟啉類化合物與DNA的相互作用[26]。

如圖2所示，水溶性銅卟啉配合物CuP-1、CuP-2和 CuP-3的 Soret帶分別位于 424.5、422.5和433.5 nm。隨著滴加CT-DNA濃度的遞增，CuP-1、CuP-2和CuP-3 Soret帶的吸收強(qiáng)度都出現(xiàn)明顯降低，且分別紅移到430.5、426.5和439 nm。其中CuP-1的Soret帶減色41.5%，紅移6 nm。而相同條件下，CuP-2和CuP-3的Soret帶分別減色25.4%和26.4%，且分別紅移了4 nm和5.5 nm。研究結(jié)果顯示，CuP-1、CuP-2和CuP-3 Soret帶的紫外吸收均出現(xiàn)紅移及減色現(xiàn)象，說明DNA堿基的π共軛體系與CuP-1、CuP-2和CuP-3的大環(huán)π*共軛體系發(fā)生了某種作用，致使π電子堆積，π電子軌道和π*空軌道發(fā)生耦合，促使π→π*躍遷能降低，表現(xiàn)為紅移。減色效應(yīng)是因為耦合作用促使π*軌道部分充滿電子，減小了π→π*躍遷，吸收峰強(qiáng)度因此降低。初步判斷CuP-1與CT-DNA可能以插入結(jié)合的方式作用，而CuP-2和CuP-3與CT-DNA是以外部溝面結(jié)合的方式作用。為了定量比較CuP-1、CuP-2和CuP-3與CT-DNA結(jié)合能力的強(qiáng)弱，根據(jù)Soret帶吸光度值隨著CT-DNA濃度的變化進(jìn)行紫外光譜滴定，測定配合物與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)。如表1所示，本實驗條件下，CuP-1、CuP-2和 CuP-3與CTDNA 的結(jié)合常數(shù) Kb分別為 1.622×105、1.004×105和1.143×105L·mol-1。說明 CuP-1、CuP-2 和 CuP-3 與DNA結(jié)合能力的大小為CuP-1＞CuP-3＞CuP-2。

圖2 CT-DNA對CuP-1(a)、CuP-2(b)和CuP-3(c)紫外可見吸收光譜的影響;(d)結(jié)合常數(shù)的測定Fig.2 Influence of CT-DNA on the absorption spectra of CuP-1(a),CuP-2(b)and CuP-3(c);(d)Determination of binding constant

2.2 EB-熒光淬滅法

熒光光譜是研究化合物與DNA相互作用的主要手段之一，由于Cuギ離子的3d軌道有單電子存在，具有順磁性，所以水溶性銅卟啉配合物CuP-1、CuP-2和CuP-3這3種金屬配位的卟啉化合物均沒有熒光，與文獻(xiàn)[27]報道一致。

EB分子本身的熒光很弱，但若存在DNA時，EB分子能夠迅速插入到DNA堿基對中并發(fā)出很強(qiáng)的熒光。原因在于EB分子插入到DNA堿基對中后，受到DNA疏水環(huán)境的保護(hù)，避免了EB分子激發(fā)態(tài)與水分子之間由于發(fā)生能量交換而產(chǎn)生的非輻射猝滅。而對于本身沒有熒光的化合物而言，化合物的加入若使EB-DNA體系的熒光明顯降低，認(rèn)為該化合物與EB發(fā)生了DNA競爭結(jié)合，EB-DNA體系熒光降低的程度就成為化合物與DNA結(jié)合能力的間接體現(xiàn)[28]。

如圖3所示，EB-DNA體系隨CuP-1、CuP-2和CuP-3的滴加，EB-DNA體系的熒光光譜均發(fā)生不同程度的熒光淬滅現(xiàn)象，表明這些配合物與CTDNA之間存在一定的相互作用。其中，隨滴加的CuP-1濃度的遞增，EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度淬滅現(xiàn)象最為明顯，EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，最后幾乎被完全猝滅，表明可能有部分EB分子已被CuP-1從EB-DNA體系中取代出來，發(fā)生了與EB分子類似的插入作用。另外，根據(jù)Stern-Volmer方程和熒光淬滅常數(shù)曲線得出CuP-1、CuP-2和CuP-3 的淬滅常數(shù)， 分別為 1.303×104、8.62×103和1.032×104L·mol-1(表 1)。 這3種陽離子卟啉化合物的Stern-Volmer淬滅常數(shù)呈現(xiàn) CuP-1＞CuP-3＞CuP-2的趨勢。淬滅常數(shù)的這種次序能反映出這些淬滅劑與CT-DNA的結(jié)合能力。熒光淬滅實驗所反映的水溶性卟啉配合物與CT-DNA結(jié)合能力的次序與紫外光譜實驗結(jié)果基本一致。

圖3 CuP-1(a)、CuP-2(b)和CuP-3(c)對EB-DNA體系熒光光譜的影響及Stern-Volmer方程的線性擬合Fig.3 Influence of CuP-1(a),CuP-2(b)and CuP-3(c)on the fluorescence spectra of EB-DNA and Linear fitting of the Stern-Volmer equation(d)

表 1 CuP-1、CuP-2和CuP-3與CT-DNA結(jié)合的參數(shù)Table 1 Parameters of CuP-1,CuP-2 and CuP-3 in binding w ith CT-DNA

2.3 粘度法研究

化合物與DNA是否發(fā)生相互作用可通過光譜學(xué)數(shù)據(jù)充分反映出來，但不能充分說明化合物與DNA的作用方式。研究化合物與DNA相互作用的實驗方法中最有說服力的是粘度法[29]。當(dāng)某種化合物與DNA以插入的方式進(jìn)行相互作用時，這種化合物會插入到DNA相鄰堿基對中，致使相鄰堿基對的距離變長，進(jìn)而增加DNA鏈的相對長度，表現(xiàn)為DNA相對粘度升高。而當(dāng)化合物與DNA以部分插入或非經(jīng)典的插入方式進(jìn)行作用時，DNA相鄰堿基對發(fā)生扭結(jié)，DNA鏈的相對長度變短，表現(xiàn)為DNA相對粘度降低。當(dāng)DNA相對粘度沒有明顯變化時，說明化合物與DNA以外部溝面結(jié)合的方式進(jìn)行作用。

水溶性銅卟啉配合物 CuP-1、CuP-2和 CuP-3滴加到CT-DNA體系(pH 7.20，TrisHCl緩沖液)后對CT-DNA相對粘度的影響，如圖4所示。當(dāng)CuP-1滴加到CT-DNA體系后，隨濃度比率r(r=ccomplex/cDNA)的遞增，CT-DNA溶液的粘度呈明顯的上升趨勢。表明CuP-1可能以插入模式與CT-DNA進(jìn)行作用。而CuP-2和 CuP-3滴加到CT-DNA體系后，CT-DNA溶液的粘度沒有明顯的變化，說明這2種配合物可能以外部溝面結(jié)合的方式與CT-DNA進(jìn)行作用。

圖4 CuP-1、CuP-2和CuP-3對CT-DNA相對粘度的影響Fig.4 Influence of CuP-1,CuP-2 and CuP-3 on the relative viscosity of CT-DNA

2.4 圓二色譜法研究

通常研究卟啉類化合物與DNA相互作用最直接的方法是圓二色譜法(CD)。具有不對稱結(jié)構(gòu)的卟啉化合物在Soret帶沒有CD信號，當(dāng)DNA與這種卟啉化合物發(fā)生相互作用時會在Soret帶產(chǎn)生誘導(dǎo)CD(ICD)信號峰。因此卟啉類化合物與DNA不同的作用模式對應(yīng)不同的誘導(dǎo)CD(ICD)信號峰。一般認(rèn)為，負(fù)的ICD信號峰，表示卟啉類化合物與DNA以插入的方式相互作用；正的ICD信號峰，表示卟啉類化合物與DNA以外部溝面結(jié)合方式相互作用；等強(qiáng)的正、負(fù)ICD信號峰，表示卟啉類化合物與DNA以外部堆積的方式相互作用[30-31]。

為進(jìn)一步證實 CuP-1、CuP-2和 CuP-3與 CTDNA的結(jié)合模式，采用CD光譜在220～500 nm的波長范圍內(nèi)研究其與CT-DNA的結(jié)合模式。如圖5所示，當(dāng) 配合物與DNA的濃度比r(r=ccomplex/cDNA)為0.05時，CuP-1在433 nm處出現(xiàn)1個較強(qiáng)的負(fù)峰，而CuP-2和CuP-3在431和430 nm處各出現(xiàn)1個正峰。這表明CuP-1與CT-DNA以插入的模式進(jìn)行作用，而CuP-2和CuP-3通過外部溝面結(jié)合的方式與CT-DNA進(jìn)行作用。

圖5 CT-DNA存在時CuP-1、CuP-2和CuP-3的誘導(dǎo)圓二色光譜Fig.5 ICD spectra of CuP-1,CuP-2 and CuP-3 in the presence of CT-DNA

以上結(jié)果表明CuP-1與CT-DNA以插入的模式進(jìn)行相互作用，而CuP-2和CuP-3通過外部溝面結(jié)合的方式與CT-DNA進(jìn)行相互作用，且CuP-1與CT-DNA的結(jié)合能力優(yōu)于CuP-2和CuP-3。可能的原因在于CuP-1的空間構(gòu)型及體積相對于CuP-2和CuP-3較小，且趨于平面，利于其嵌入到DNA的堿基對中成鍵，與CT-DNA以插入的模式進(jìn)行結(jié)合。CuP-2和CuP-3結(jié)構(gòu)中由于芳香環(huán)上存在N雜環(huán)取代基，會使CuP-2和CuP-3與DNA結(jié)合時產(chǎn)生較大的空間位阻，因此CuP-2和CuP-3易從外部與CT-DNA分子進(jìn)行鍵合，與CT-DNA以外部溝面結(jié)合的模式進(jìn)行作用。且CuP-2和CuP-3結(jié)構(gòu)中芳香環(huán)上N雜環(huán)取代基含有帶孤電子對的N原子，影響復(fù)合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響CuP-2和CuP-3與CT-DNA的結(jié)合效果。

2.5 M TT法測定CuP-1～CuP-3對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

基于水溶性銅卟啉配合物CuP-1～CuP-3與CTDNA以不同的結(jié)合模式進(jìn)行相互作用，以及卟啉類化合物對腫瘤細(xì)胞良好的靶向作用及其結(jié)構(gòu)的特異性[32]，本文以人成纖維細(xì)胞(L929)為正常細(xì)胞系，以宮頸癌細(xì)胞(Hela)和乳腺癌細(xì)胞(MDA)為測試細(xì)胞株，考察了CuP-1～CuP-3的體外抗腫瘤活性。

不同濃度、不同作用時間的條件下，CuP-1～CuP-3對Hela和MDA的抑制率如圖6～8所示。結(jié)果表明，隨濃度和作用時間的增大，CuP-1～CuP-3對Hela和MDA的抑制率呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，其中CuP-1對2種腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于其溴取代衍生物CuP-2和CuP-3。通常，利用化合物的半數(shù)有效濃度IC50來評價其藥效，IC50值越小表明其藥效越好。如表2所示，CuP-1對Hela和MDA分別作用 24、48、72 h 后的 IC50值分別為：59.399、42.513和 33.956 μmol·L-1以及 107.094、60.215 和 46.406 μmol·L-1；可知在相同條件下，CuP-1 對 Hela 的體外增殖抑制作用優(yōu)于MDA，且作用72 h時其抑制率最高，說明CuP-1對Hela可能具有特定的靶向性。而CuP-2和CuP-3對Hela和 MDA分別作用 24、48、72 h 后的 IC50值均大于 119 μmol·L-1(表 2)，表明CuP-2和CuP-3對2種腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用相對于CuP-1的抑制作用較弱，可能與其和CT-DNA的作用模式有關(guān)。另外，從表2中可知，CuP-1～CuP-3對L929的抑制率均很弱，其可能的原因在于卟啉環(huán)對腫瘤細(xì)胞的選擇性[33]。

圖6 CuP-1對2種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.6 Proliferation inhibition of CuP-1 on two kinds of tumor cell lines

圖7 CuP-2對2種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.7 Proliferation inhibition of CuP-2 on two kinds of tumor cell lines

圖8 CuP-3對2種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.8 Proliferation inhibition of CuP-3 on two kinds of tumor cell lines

表 2 CuP-1～CuP-3 的 IC50值Table 2 IC50 values of CuP-1～CuP-3

3 結(jié) 論

基于A4型吡啶基陽離子卟啉具有與DNA強(qiáng)的插入作用及潛在的抗癌活性，合成了A3B型含溴的吡啶基陽離子銅卟啉CuP-1，進(jìn)而通過官能團(tuán)修飾，取代溴原子合成了其衍生物CuP-2和CuP-3，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。采用紫外光譜法、EB-熒光淬滅法、粘度法和圓二色譜法研究了它們與CT-DNA的相互作用。結(jié)果表明，CuP-1與CT-DNA以插入的模式進(jìn)行作用，而CuP-2和CuP-3與CT-DNA以外部溝面結(jié)合的方式進(jìn)行作用，且CuP-1與CT-DNA的結(jié)合能力優(yōu)于CuP-2和CuP-3?；谶策惢衔飳δ[瘤細(xì)胞良好的靶向作用及其結(jié)構(gòu)的特異性，研究了CuP-1～CuP-3的體外抗腫瘤活性。實驗結(jié)果表明，CuP-1～CuP-3對Hela和MDA均有體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，呈時間、劑量依賴關(guān)系。其中CuP-1對2種腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其溴取代衍生物CuP-2和CuP-3，可能和CuP-1與DNA相互作用較強(qiáng)及結(jié)合模式有關(guān)，表明配合物與DNA的插入作用模式可能是配合物具有抗腫瘤活性的原因之一。且CuP-1對Hela的抑制增殖作用明顯優(yōu)于MDA，表明CuP-1對Hela具有特定的靶向性，說明卟啉類化合物對腫瘤細(xì)胞存在靶向性篩選。