張 翠

（肥城礦業(yè)中心醫(yī)院檢驗科，山東 肥城 271608）

膿毒癥是由多種因素導致的全身炎癥反應綜合征，為兒科監(jiān)護室的常見危重癥，，病情進展迅速，若不能盡早診斷和治療，可導致休克、多系統(tǒng)多器官衰竭，甚至死亡，是導致患兒死亡的主要因素[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為廣泛存在于機體內(nèi)的短鏈非編碼RNA，在調(diào)控細胞生長、器官發(fā)生、免疫反應中發(fā)揮著重要作用[2]。有研究指出miR-132參與了脂多糖誘導大鼠肺泡巨噬細胞炎癥反應[3]。高遷移率族蛋白1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作為一種重要的促炎癥因子，在介導炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用[4]。本研究擬對膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA的相對表達水平進行檢測，并探討其與患兒預后的關聯(lián)，以期為膿毒癥機制研究提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年5月—2016年6月在山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院住院治療的膿毒癥患兒87例，其中男58例、女29例，年齡3個月～5歲，均符合兒童膿毒癥診斷標準[5]。排除標準：伴有心、肝、腎等重要臟器功能不全者，以及先天性心臟病者；具有嚴重藥物過敏史、治療配合不佳者。根據(jù)患兒預后情況分為死亡組和非死亡組，其中死亡組25例（男15例，女10例），年齡（2.08±0.25）歲，非死亡組62例（男43例，女19例），年齡（2.17±0.26）歲。選取同期山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院兒保中心健康兒童50名作為對照組，其中男29例、女21例，年齡3個月～5歲。膿毒癥患兒和對照組性別、年齡等一般情況差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究通過山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象的監(jiān)護人均知情同意。

1.2 方法

所有膿毒癥患兒于確診后進行全身性感染相關性器官功能衰竭（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）評分。分別抽取膿毒癥患兒確診后12 h內(nèi)和對照組體檢當日空腹靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管內(nèi)，通過密度梯度法分離單個核細胞。將等體積的生理鹽水加入全血中進行稀釋，取已稀釋好的血液緩慢加在淋巴細胞分離液（美國Sigma公司）之上，800×g離心20 min，留取中間白色環(huán)狀層液體，加入生理鹽水混合均勻，3 000×g離心10 min，棄上清，留取細胞以備檢。加入細胞裂解液裂解，利用Trizol總RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司）對單個核細胞中總RNA進行提取，并檢測總RNA純度。取1 μg總RNA用逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）逆轉錄為模板鏈，采用LightCycler 480熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀進行擴增，按照熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進行操作。引物序列由上海生工生物公司設計合成。miR-132引物：上游5'-GCCCGTAACAGTCTACAGCCAT-3'，下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；HMGB1引物：上游5'-ACATCCAAAATCTTGATCAGTTA-3'，下游5'-AGGACAGACTTTCAAAATG-TTT-3'；β-actin引物：上游5'-AGCGAGCATCC-CCCAAAGTT-3'，下游5'-GGGCACGAAG-GCTCATCATT-3'。PCR反應條件：95 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次，每個樣品均設置3個平行反應復孔。用2-ΔΔCt法計算外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 膿毒癥患兒和對照組外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平的比較

膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量均高于對照組（P＜0.05）；死亡組患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量均高于非死亡組和對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平的相關性

表1 膿毒癥患兒和對照組外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平的比較 （±s）

表1 膿毒癥患兒和對照組外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平的比較 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與非死亡組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) miR-132 HMGB1 mRNA膿毒癥患兒 87 1.59±0.24* 1.63±0.11*死亡組 25 1.90±0.21*△ 1.71±0.12*△非死亡組 62 1.47±0.11* 1.59±0.09*對照組 50 1.27±0.14 1.12±0.08

Pearson相關分析顯示，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132相對表達量與HMGB1 mRNA相對表達量呈正相關（r=0.521，P＜0.001）。

2.3 膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平與SOFA評分的相關性

Pearson相關分析顯示，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量均與SOFA評分呈正相關（r=0.438，0.507，P＜0.001）。

2.4 miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平在預測患兒預后中的價值

ROC曲線分析顯示，miR-132相對表達量在預測患兒預后時，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.921，95% 可信區(qū)間（confidence interval，CI）為0.853～0.989，臨界值為1.57時，敏感性為84.0%，特異性為87.1%；HMGB1 mRNA相對表達量在預測患兒預后時，AUC為0.858，95%CI為0.769～0.947，臨界值為1.72時，敏感性為68.0%，特異性為90.3%；二者聯(lián)合檢測在預測患兒預后時，AUC為0.941，95%CI為0.878～1.000，敏感性為88.0%，特異性為91.9%。見圖2。

3 討論

圖2 miR-132和HMGB1表達預測患兒預后的ROC曲線

膿毒癥作為由多種因素引起的全身炎癥反應，是兒科最常見的危重癥。近年來，發(fā)病率呈逐年升高趨勢[6]。目前，膿毒癥具體發(fā)生機制尚未完全清楚。有研究指出，膿毒癥病情進展甚至死亡與機體炎癥反應及免疫功能紊亂密切相關[7]。miRNA作為廣泛存在并參與機體多項生理功能的高度保守的短鏈RNA，可穩(wěn)定存在于機體中，但當機體受內(nèi)、外環(huán)境影響或多種疾病早期時，其表達便可改變[8]，已成為多種疾病早期診斷及預后評估的指標[9]，對膿毒癥診斷及預后具有評估價值[10]，且miRNA參與調(diào)控了炎癥反應及免疫過程[11]。有研究指出，miR-132在調(diào)節(jié)炎癥反應及免疫抑制中發(fā)揮重要作用[12]。HMGB1作為廣泛存在、高度保守的DNA結合蛋白，是一種新型炎癥介質，在介導炎癥所致多種損傷中發(fā)揮關鍵性作用[13]。本研究分析了膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1表達，結果顯示與對照組相比，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量均升高，說明miR-132和HMGB1在膿毒癥患兒外周血單個核細胞中呈高表達，提示miR-132和HMGB1可能參與了膿毒癥患兒發(fā)病。

本研究結果顯示，死亡組患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量均高于非死亡組，說明miR-132和HMGB1可能與患者預后有關。同時也從另一方面提示外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1表達與患者病情嚴重程度有關。Pearson相關分析顯示，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132相對表達量與HMGB1 mRNA相對表達量呈正相關，說明miR-132和HMGB1可能共同參與了膿毒血癥患兒發(fā)病過程。SOFA評分是目前臨床上常用的描述器官功能不全或衰竭發(fā)展過程的指標，是評估患者病情及預測預后的重要指標[14]，本研究結果顯示，膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達量均與SOFA評分呈正相關，說明膿毒癥患兒外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對表達水平可作為評估膿毒癥患兒病情的客觀指標。ROC曲線分析結果顯示，miR-132表達量在預測患兒預后時，AUC為0.921，敏感性為84.0%，特異性為87.1%，HMGB1 mRNA表達量則分別為0.858、68.0%和90.3%，說明外周血單個核細胞中miR-132和HMGB1表達量可作為評估患兒預后的指標，尤其是二者聯(lián)合檢測時，預測的敏感性和特異性均增加，分別為88.0%和91.9%。

綜上所述，miR-132和HMGB1在膿毒癥患兒外周血單個核細胞中表達升高，且與患兒預后有關，可作為早期評估患兒預后的指標，對判斷患兒病情嚴重程度及預后具有一定的參考意義。