李懿皞， 周 琰， 陳 樸， 胡玉懿， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤（lymphoplasmacytic l y m p h o m a，L P L）/華氏巨球蛋白血癥（Waldenstr?m macroglobulinemia，WM）是一種少見的具有漿細(xì)胞樣分化特征的小B細(xì)胞惰性淋巴瘤，在非霍奇金淋巴瘤中的發(fā)病率＜2%。以往由于LPL/WM與淋巴結(jié)邊緣區(qū)淋巴瘤（nodal marginal zone lymphoma，NMZL）、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）等難以鑒別診斷，且缺乏相關(guān)特征性的細(xì)胞免疫標(biāo)志物，通常采用排他法診斷，流程通常較長(zhǎng)，不利于患者的及時(shí)診治。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，超過90%的LPL/WM患者中存在髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）基因L265P突變，這為臨床提供了分子診斷依據(jù)。本研究報(bào)道1例通過檢測(cè)MyD88基因 L265P點(diǎn)突變輔助診斷LPL/WM的病例。

1 病例

患者，男，66歲，自2016年起出現(xiàn)無(wú)明顯誘因的乏力、納差，伴消瘦，半年內(nèi)體重減輕15 kg。無(wú)頭暈、頭痛，無(wú)發(fā)熱出汗，無(wú)胸悶、胸痛，無(wú)骨痛及骨折。2017年2月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診。血常規(guī)：血紅蛋白78 g/L，血小板計(jì)數(shù)217×109/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)2.73×1012/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)5.38×109/L，紅細(xì)胞沉降率66 mm/H，血細(xì)胞比容22.2%，單核細(xì)胞百分比20.1%，鏡檢見少量未成熟粒細(xì)胞（0.4%）。血液生化檢查：IgM 19.70 g/L，IgG 13.50 g/L，IgA 0.82 g/L，IgE 37.00 IU/mL，κ輕鏈 5.68 g/L，血清蛋白電泳見γ區(qū)M蛋白，其他生化、免疫指標(biāo)均未見異常。

2 診療

2.1 試劑與儀器

Capillarys2 Flex Piercing毛細(xì)管電泳儀、HYDRASYS 2免疫固定電泳儀（法國(guó)Sebia公司），F(xiàn)ACS Canto II分析型流式細(xì)胞儀及相關(guān)流式抗體（美國(guó)BD公司），CX-31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），7600-020全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。LightCycler 480實(shí)時(shí)定量PCR儀（瑞士Roche公司）。Premix Taq Hot Start Version擴(kuò)增體系[寶生物工程（大連）有限公司]。ABI 3130型遺傳分析儀（美國(guó)Theromo Fisher公司）及相關(guān)配套試劑。Lab-Aid 820 DNA抽提儀（廈門致善公司）及配套試劑。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 免疫固定電泳及血清蛋白電泳結(jié)果 結(jié)合血常規(guī)及生化報(bào)告，考慮血液系統(tǒng)疾病，收治入院。行血清蛋白電泳檢測(cè)：白蛋白 38.4%，γ區(qū)35.1%，γ區(qū)存在M蛋白。 復(fù)查免疫固定電泳結(jié)果為陽(yáng)性，可見IgM-κ型M帶，M蛋白濃度17.3 g/L，M蛋白百分比為24.0%，見圖1。

2.2.2 骨髓病理活檢 追加骨髓病理活檢、骨髓細(xì)胞免疫分型檢測(cè)，骨髓細(xì)胞涂片提示骨髓增生明顯活躍，淋巴細(xì)胞比例增高占43%，部分有漿樣分化表現(xiàn)。免疫組化結(jié)果示造血組織中可見到大量B淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞數(shù)目未增多，B淋巴細(xì)胞約占骨髓有核細(xì)胞的55%，漿細(xì)胞約占骨髓有核細(xì)胞的5%，呈多克隆性，B淋巴細(xì)胞腫瘤性增生，考慮B細(xì)胞淋巴瘤累及骨髓。見圖2。

圖1 患者血清免疫固定電泳

2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19。 側(cè)向散射（side scatter，SSC）設(shè)門見B淋巴細(xì)胞κ陽(yáng)性克隆 98.3%，呈限制性表達(dá)；CD22 97.6%，CD23 24.4%，F(xiàn)MC-7 16.2%，CD25 52%。見圖3。

圖2 患者骨髓涂片

2.2.4 MyD88基因 L265P突變檢測(cè) 根據(jù)骨髓活檢和免疫分型結(jié)果，考慮淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥可能性大。采用Sanger測(cè)序法行MyD88基因L265P突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在第794位堿基發(fā)生T→C的改變。見圖4。

MyD88基因 L265P突變檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，臨床確診為WM。采用烷化劑聯(lián)合重組人促紅細(xì)胞生成素的方案治療3 d后，患者狀況良好出院，醫(yī)囑定期隨訪。

圖3 患者骨髓淋巴細(xì)胞流式圖（CD19/SSC設(shè)門）

圖4 Sanger測(cè)序法檢測(cè)MyD88 L265P點(diǎn)突變

3 討論

本病例中，患者紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白明顯下降，血小板計(jì)數(shù)正常，紅細(xì)胞沉降率加快。生化檢測(cè)血清蛋白電泳提示M蛋白，IgM和κ鏈顯著升高，尿中存在κ輕鏈。免疫固定電泳報(bào)告IgM-κ型陽(yáng)性M條帶，高度懷疑為血液系統(tǒng)腫瘤疾病，加做骨髓活檢、細(xì)胞免疫和MyD88 L265P點(diǎn)突變檢測(cè)。細(xì)胞免疫CD19/SSC設(shè)門見B淋巴細(xì)胞κ克隆限制性表達(dá)、FMC-7表達(dá)缺如、CD20（+）、CD25（+）；骨髓活檢顯示CD20（+）、CD23（灶性+），均支持LPL/WM診斷。最終MyD88 基因L265P點(diǎn)突變檢測(cè)陽(yáng)性，臨床確診為L(zhǎng)PL/WM。

本病例中的WM是一種罕見的血液系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率隨年齡增加而升高，具有一定家族傾向性，中位診斷年齡為63～68歲。在患有其他惡性腫瘤性疾病的人群中，WM的發(fā)病率較一般人有所增高。WM的發(fā)病主要與骨髓、腫瘤器官浸潤(rùn)和異常IgM生成有關(guān)，主要臨床表現(xiàn)包括高黏滯綜合征、冷球蛋白血癥、冷凝集素性溶血性貧血、外周神經(jīng)病變、淀粉樣變及腎小球病變等[1]。WM患者外周血一般不受累，細(xì)胞免疫表型特征包括：CD19 （+）、CD20（+）、slgM（+）、CD22（+）、CD79（+）、CD25（+），約20% 的WM患者存在CD5、CD10和CD23的表達(dá)[2]。在WM患者中，MyD88 L265P以及CXCR4 WHIM突變較為常見，且這2種突變均和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、存活相關(guān)，前者在WM患者中的突變頻率更高，達(dá)90%以上[3]。也有文獻(xiàn)報(bào)道ARID1A是WM中一個(gè)重要的突變位點(diǎn)[4]。目前，WM的治療策略主要包括抗CD20單克隆抗體、烷化劑、核苷類似物、蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物、依維莫司等，其中MyD88和CXCR4基因的點(diǎn)突變是WM主要的治療和診斷靶點(diǎn)[5]。

MyD88是一種可溶性的銜接蛋白，屬于Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）/白細(xì)胞介素1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族，能介導(dǎo)多數(shù)TLR、IL-1R和IL-18R細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要包含TIR、DD和ID3個(gè)功能區(qū)域[6]。MyD88基因L265P點(diǎn)突變是WM最主要的突變之一，其突變位點(diǎn)處于TIR結(jié)構(gòu)域中，表現(xiàn)為Myd88基因編碼序列第794位堿基發(fā)生T向C突變，導(dǎo)致Myd88蛋白編碼區(qū)第265位的亮氨酸錯(cuò)義突變?yōu)楦彼醄4]。這種突變能使其成為TLR和IL-1R信號(hào)通路的受體分子，從而激活白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶1和2，活化Janus 激活酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3通路及核因子-κB通路，從而促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖、逃避細(xì)胞周期抑制、阻滯細(xì)胞分化成熟，導(dǎo)致腫瘤形成。有研究發(fā)現(xiàn)，超過90%的LPL/WM患者都能出現(xiàn)MyD88 L265P的基因突變[7-8]，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該突變可見于部分IgM型（不見于IgG或IgA型）意義未明免疫球蛋白血癥和約30%非生發(fā)中心型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[9]，但在漿細(xì)胞骨髓瘤中即使是IgM型也無(wú)此突變。MyD88基因的L265P點(diǎn)突變檢測(cè)一般依靠Sanger測(cè)序或具有較高敏感度的等位基因特異-聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)進(jìn)行[4]，熒光原位雜交法也是一種檢測(cè)的手段[9]。目前LPL/WM診斷與治療的專家共識(shí)認(rèn)為，MyD88基因 L265P點(diǎn)突變是WM診斷與鑒別診斷的重要標(biāo)志，對(duì)臨床鑒別診斷B細(xì)胞相關(guān)血液系統(tǒng)腫瘤有著重要的意義[2]。另外，MyD88 L265P點(diǎn)突變的檢測(cè)和研究對(duì)WM患者靶向治療的開發(fā)有著重要的意義，依魯替尼等藥物能抑制MyD88基因L265P靶點(diǎn)的酪氨酸激酶受體，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

WM是一種罕見的淋巴細(xì)胞腫瘤，既往由于沒有特征性的免疫學(xué)及分子生物學(xué)標(biāo)志物，往往采用排除性的方法進(jìn)行診斷。MyD88基因L265P點(diǎn)突變是WM有別于許多B系淋巴瘤的1個(gè)重要標(biāo)志物，有助于區(qū)分LPL/WM和其他淋巴瘤疾病，具有一定的臨床價(jià)值。但其在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、IgM型意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥中也有表達(dá)，因此MyD88基因L265P點(diǎn)突變并非WM的特異性診斷標(biāo)志物。聯(lián)合臨床表現(xiàn)、血清蛋白電泳、免疫固定電泳、細(xì)胞免疫分型、骨髓病理活檢和MyD88基因L265P點(diǎn)突變的檢測(cè)，有助于對(duì)WM更為準(zhǔn)確的診斷和治療，同時(shí)也為靶向治療提供了方向。