Sibila M Pieters M Molitor T Maes D Haesebrouck F Segales J

陳善真1 曹仁祺2 饒 雷2 張居榮2 陳海輝2 林顯站2 王貴平*譯

（1廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東廣州 511400；2陽西縣豐沃生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，廣東陽江 529800）

豬支原體是豬地方性肺炎的主要病原，其他病原如巴氏桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌、豬鼻支原體、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、化膿隱秘桿菌也經(jīng)常繼發(fā)感染。該病的特征是高發(fā)病率和低死亡率，盡管各年齡段的豬群均易感，但地方性肺炎在小于6周齡的仔豬群中并不常見。肥育中期到屠宰期間的青年豬地方性肺炎的流行率特別高，而臨床癥狀的嚴重程度取決于豬支原體毒株、感染壓力、是否存在繼發(fā)感染和環(huán)境因素。當肺炎支原體感染未伴有其他病原繼發(fā)感染時，地方性肺炎表現(xiàn)為亞臨床經(jīng)過，伴隨輕微的臨床癥狀包括慢性干咳、平均日增重減少和飼料轉(zhuǎn)化率降低；當伴隨繼發(fā)感染時，臨床癥狀包括呼吸困難、發(fā)熱，偶爾出現(xiàn)死亡。

豬支原體密切參與了豬呼吸道綜合征的發(fā)病，該病是既有細菌（可能潛在參與了地方性肺炎的細菌）又有病毒（豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬2型圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒）參與的疾病。豬呼吸道綜合征通常影響14～20周齡的育肥豬，臨床主要表現(xiàn)為生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率下降，同時伴有食欲減退、發(fā)燒、咳嗽和呼吸困難。該病在此階段豬群高度流行，所以也被稱為“18周齡墻”。

盡管通過改進管理措施、合理地使用藥物和疫苗，很大程度上減輕了地方性肺炎對豬群健康和胴體品質(zhì)的不利影響，地方性肺炎對全世界養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟損失仍然不容忽視。這些損失主要歸因于日增重降低、料肉比增高、藥物治療費用增加，在一些案例中，死亡率也在增加。

充分了解豬肺炎支原體及其他相關(guān)病原的傳播途徑，對于控制該病、理解該病發(fā)病機制的影響因素是必要的?？偨Y(jié)了在目前不同生產(chǎn)系統(tǒng)下豬支原體傳播和血清轉(zhuǎn)換動力學(xué)的知識，比較了監(jiān)測地方性肺炎的不同流行病學(xué)工具，同時討論了豬支原體肺炎毒株的不同毒力特征和目前檢測應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。

1 評估豬支原體感染的流行病學(xué)和診斷學(xué)工具

調(diào)查和控制傳染性疾病取決于診斷方法的可利用性。下面介紹幾種監(jiān)測豬支原體感染常用的診斷方法。

1.1 臨床癥狀

地方性肺炎的主要臨床表現(xiàn)是逐漸出現(xiàn)慢性干咳，尤其是在生產(chǎn)周期的育肥豬階段。和如前所述的其他病原共感染后導(dǎo)致發(fā)熱、厭食和呼吸困難。雖然是逐漸出現(xiàn)的，但咳嗽反復(fù)發(fā)作，程度也因豬支原體的感染劑量不同有所差別。為了確認豬是否干咳，對于豬群的觀察需要足夠的時間跨度，而且最好是趕豬運動。在給定時間段內(nèi)確定咳嗽豬的頭數(shù)（“咳嗽評分系統(tǒng)”）已經(jīng)被用于豬肺炎支原體傳播和致病機制的研究，也被用于評估豬支原體疫苗對自然感染和實驗條件下感染豬的免疫效果。然而，考慮到缺乏咳嗽的診斷特異性而且亞臨床感染的豬不會表現(xiàn)咳嗽癥狀，還需要配合使用其他診斷方法。

1.2 屠宰監(jiān)測

在屠宰檢查時，利用“肺部病變評分”系統(tǒng)評價豬群呼吸道疾病，是評估地方性肺炎發(fā)病率及其對胴體市場價格影響的常用方法。據(jù)估計，為了準確測量1個豬場的肺炎發(fā)病率和嚴重程度，至少需要檢查30頭豬的肺臟。這種方法對于檢查在育肥階段影響生產(chǎn)的亞臨床疾病也很有幫助。然而，地方性肺炎病變并不是豬支原體感染所特有的，因為其他病原（比如豬流感病毒）也能產(chǎn)生類似病變。

通過屠宰場監(jiān)測，回顧性分析地方性肺炎的發(fā)病率，這種方法的局限在于只能確認生產(chǎn)階段后期的慢性肺臟病變，并不能提供關(guān)于育肥豬動態(tài)的呼吸系統(tǒng)健康信息。同樣，其他細菌感染，如傳染性胸膜肺炎，導(dǎo)致嚴重的胸膜炎而掩蓋了地方性肺炎的病變。病變消除可能造成檢測的假陰性結(jié)果，或者對早期支原體病得出1個模棱兩可的診斷結(jié)果。表1中總結(jié)了屠宰場監(jiān)測最常用的肺臟病變評分系統(tǒng)。視覺評估肺臟實變比例帶有主觀性以及損傷診斷缺乏特異性，限制了屠宰場監(jiān)測方法的應(yīng)用，因此需要其他驗證方法。

表1 屠宰場監(jiān)測地方性肺炎所用評分系統(tǒng)匯總

1.3 細菌培養(yǎng)

通過細菌培養(yǎng)從感染肺臟中分離豬支原體，被認為是診斷豬支原體的“金標準”，但是分離病原需要特殊的Friis培養(yǎng)基。S?rensen等比較了監(jiān)測豬支原體的幾種方法：細菌培養(yǎng)、免疫熒光（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和PCR，發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)是最敏感的方法，特別是在地方性肺炎感染后期只有少量豬支原體存在的時候。然而，豬支原體培養(yǎng)是費力費時的（從臨床樣品中分離需要4～8周時間），而且培養(yǎng)基上經(jīng)常長滿豬鼻支原體或絮狀支原體。

1.4 豬支原體感染的血清學(xué)檢測

血清學(xué)試驗經(jīng)常被用來監(jiān)測豬群健康狀況。豬支原體抗體的檢測可以通過ELISA，少數(shù)情況下使用補體結(jié)合實驗。豬群的支原體抗體需要應(yīng)用ELISA方法對不同生長階段的豬群進行同步檢測（橫向研究）或者對整個生產(chǎn)周期中的某一豬群進行檢測（縱向研究）。在這種情況下，ELISA方法是一種快速、廉價且易于自動化的方法，在測定母源抗體和獲得性抗體水平、豬群血清轉(zhuǎn)陽所需時間方面，都提供了有用的信息。阻斷ELISA（IDEI，豬支原體EIA試劑盒，Oxoid）和兩個間接ELISA試驗（Herdcheck，IDEXX和Tween 20-ELISA）是最常用的檢測豬支原體血清抗體的方法。對于這些試劑盒的特異性和敏感性，也有學(xué)者比較研究報道過。當血清學(xué)檢測結(jié)果出現(xiàn)不一致時，針對不同豬支原體抗原的蛋白印跡分析（WBI）可被用作確證試驗。支原體抗體的實用性受到下列5個因素干擾：ELISA結(jié)果的差異（取決于檢測所用的方法）；血清學(xué)檢測不能區(qū)分自然感染和疫苗接種抗體；不同測量方法的抗體滴度之間缺乏相關(guān)性；不同毒株豬支原體導(dǎo)致的抗體差異；豬群血清轉(zhuǎn)陽時間的顯著差異。

自然條件下豬支原體血清轉(zhuǎn)陽較實驗條件下緩慢，不過豬經(jīng)氣管內(nèi)感染肺炎支原體后2～4周，可以檢測到抗體。S?rensen等報道，在經(jīng)空氣感染的豬群中，盡管一部分豬只最早在感染后8天就血清轉(zhuǎn)陽，但其他的豬群需要再經(jīng)過5周時間才會轉(zhuǎn)陽。在自然條件下，Morris等發(fā)現(xiàn)，豬群在接觸感染后3周，就出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)陽，抗體滴度在感染后11周達到高峰。在另外兩項田間試驗中，血清轉(zhuǎn)陽主要發(fā)生在生長育肥豬單元（8～24周階段），在感染后6～9周時間。豬支原體感染后血清轉(zhuǎn)陽延遲，部分原因在于支原體吸附在呼吸道纖毛上皮細胞上，并不像其他病原那樣入侵到肺臟組織。這可能導(dǎo)致支原體抗原較緩慢地遞呈給宿主細胞。此外需要注意的是支原體抗體滴度和抗支原體感染的保護力無關(guān)。

1.5 豬支原體抗原的檢測

盡管免疫組化（IHC）和IFA試驗?zāi)芴禺愋缘貦z測出肺組織切片或者涂片中豬支原體，但這些技術(shù)的缺點是診斷只能在動物死后進行。而且，使用這些技術(shù)時只能檢測小塊的肺臟樣品，如果樣品中不含有呼吸道組織，這就增加了假陰性結(jié)果的風險。另外，檢測的敏感性可能因為組織樣品處理不當而大打折扣。如果多抗與其他的支原體緊密相關(guān)，這些檢測方法中使用的抗體質(zhì)量也可能限制了其特異性。

雖然通過IHC，利用特異性的單抗或多抗檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的肺臟切片中的豬支原體，可以讓病理學(xué)家把支原體抗原的出現(xiàn)和地方性肺炎損傷關(guān)聯(lián)在一起，但這項技術(shù)由于靈敏度低，并不是實驗室診斷的常規(guī)技術(shù)。直接和間接IFA已被用于定位豬肺臟中的支原體抗原。在致病機制和傳播研究的診斷中，也有人將IFA和PCR方法做了對比。當動物體內(nèi)支原體載量較高時，IFA的陽性結(jié)果和地方性肺炎較急性感染階段相關(guān)；當動物體內(nèi)支原體載量較低時，與該方法在其他慢性疾病中較低的靈敏度不同。IFA方法進一步的局限性在于使用冰凍切片時，人工組織碎片可能遮蔽形態(tài)學(xué)特征。

2 分子診斷方法

2.1 原位雜交

原位雜交用來檢測和特異性定位經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的在自然和實驗條件下感染的豬的肺臟組織中的支原體DNA。這項技術(shù)采用地高辛標記的特異探針，靶基因是支原體基因組的重復(fù)序列。熒光標記的寡核苷酸探針定位的16S核糖體DNA序列，也被用來鑒定豬支原體、豬滑液支原體和豬鼻支原體的種特異性。原位雜交方法的缺點是需要動物死后的解剖樣本，而且此方法相對耗時，因此并不適用于快速診斷。

2.2 PCR

表2列出了用于檢測不同樣本中豬支原體DNA的PCR檢測方法。這些方法比細菌培養(yǎng)更迅速而且價格相對低廉。然而，PCR方法樣品污染也比較嚴重?？紤]到支原體活的或死的DNA都可以擴增，PCR確定的陽性豬群是否是活躍感染就是個問題。因為支原體是吸附在氣管纖毛的上皮細胞上，用PCR檢測豬肺炎支原體最好的樣品是氣管-支氣管拭子或者支氣管肺泡灌洗液（BALF）。氣管-支氣管拭子和BALF同樣可以預(yù)測活體和死后實驗性感染豬的感染狀況。利用PCR方法檢測肺組織的豬支原體已經(jīng)產(chǎn)生了差異較大的結(jié)論。Moorkamp等發(fā)現(xiàn)，在中等或嚴重的地方性肺炎病例中肺組織比BALF樣品更適合，而Kurth等發(fā)現(xiàn)在這種環(huán)境下檢測肺組織樣品是不可靠的。

表2 已報道的基于PCR檢測豬支原體的方法匯總

理想的情況下，一種檢測活體動物體內(nèi)病原的方法應(yīng)該具備操作簡便、快速且成本低廉的特點，而且能夠提供數(shù)據(jù)支持控制措施的實施。盡管在理論上利用PCR檢測活豬鼻腔內(nèi)的支原體符合上述標準，但研究表明，經(jīng)氣管內(nèi)進行支原體攻毒感染的豬上呼吸道內(nèi)只有少量病原體存在，而且是間歇性地排毒。然而，采用PCR方法從鼻拭子中診斷自然感染被發(fā)現(xiàn)是可信的，而且鼻腔內(nèi)豬支原體的檢出和支氣管內(nèi)地方性肺炎造成的損傷是相關(guān)的。

盡管使用巢式PCR（n-PCR）檢測活體內(nèi)豬支原體的鼻拭子樣本的潛力已被報道，但目前來看這項技術(shù)更適合用于豬群而非動物個體水平上支原體的監(jiān)測。

利用PCR方法檢測豬支原體，為確定豬群何時感染提供了一種更加精確的方法，因為血清轉(zhuǎn)化需要時間，而這個時間長短差別較大。

2.3 分子分型技術(shù)

地方性肺炎臨床發(fā)病過程的差異和支原體疫苗免疫效果的不一致，引起了人們對豬支原體分離株毒力不同的懷疑。

不同豬支原體分離株在抗原性、染色體組、基因組、蛋白質(zhì)組等水平上均存在差異。Vicca等最終揭示了這些分離株的不同毒力特征。豬支原體在吸附和傳播能力上的不同也被提及，但還沒有得到清晰的證明。

表3 對豬支原體田間毒株基因進行分型的分子技術(shù)匯總

從流行病學(xué)角度看，對豬支原體分離株進行分型有助于理解支原體在豬群內(nèi)和豬群間的傳播。表3列出了最近描述的分子分型技術(shù)，指出一種毒株可感染某一特定豬群，而參與不同支原體感染的毒株也不盡相同。

譯自：Sibila M,Pieters M,Molitor T,et al.Current perspectives on the diagnosis and epidemiology of Mycoplasma hyopneumoniae infection[J].Veterinary Journal,2009,181(3):221-231.