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血管內(nèi)皮功能不全在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有效預(yù)防內(nèi)皮功能受損可延緩乃至逆轉(zhuǎn)相關(guān)病變進(jìn)程。一氧化氮(nitric oxide，NO)是目前所知最有效的內(nèi)源性血管舒張因子，能有效舒張血管，調(diào)節(jié)血壓。體內(nèi)NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下產(chǎn)生。內(nèi)源性NOS競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)與血管內(nèi)皮功能失調(diào)密切相關(guān)，是內(nèi)皮功能失調(diào)新的危險(xiǎn)因子[1]。ADMA競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS活性，減少NO生成可能是其致血管內(nèi)皮功能失調(diào)的主要機(jī)制。

奈必洛爾(Nebivolol)是一種新型抗高血壓藥，選擇性阻斷β1受體，并具有NO依賴(lài)性血管舒張作用。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奈必洛爾可改善自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷情況，其作用可能與減少ADMA生成有關(guān)[2]。但奈比洛爾是否可以直接對(duì)抗ADMA引起的細(xì)胞損傷還未有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)觀察奈必洛爾對(duì)ADMA損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的拮抗作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供(來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。ADMA購(gòu)自Sigma公司；NO、NOS測(cè)定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)引物購(gòu)自北京奧科生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC解凍復(fù)蘇后，無(wú)菌條件下移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，置二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞80%融合時(shí)，換成含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)到同步化，然后分別加入不同的藥物處理。1.3 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組：用含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h；ADMA組：用含16 μmol/L ADMA的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h；不同劑量奈比洛爾組：分別加入終濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的奈比洛爾孵育細(xì)胞1 h后， 加入16 μmol/L ADMA繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h；阿替洛爾組：加入終濃度20 μmol/L的阿替洛爾與孵育細(xì)胞1 h后，加入16 μmol/L ADMA繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h。離心收集細(xì)胞和培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞上清液NO含量、NOS活性測(cè)定 不同因素處理細(xì)胞后，0.25%胰酶消化、收集細(xì)胞懸液，低速離心收集細(xì)胞上清液。細(xì)胞上清液中NO含量和NOS活性檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 RT-PCR檢測(cè)eNOSmRNA表達(dá) 按照Qiagen 公司RNeasy Mini Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。將提取的RNA樣品經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，取1 μL RNA 樣品稀釋50倍，用于定量實(shí)驗(yàn)。eNOS引物(上游：5′-AGGAGGCCTTCCGAGGCTGG-3′，下游：5′-GGTGGCCCTCGTGGACTTGC-3′， 260bp)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物(上游：5′-TCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游：5′-GATGACCTTGCCCACAGCCTTG-3′，307bp)。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，行30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取電泳級(jí)瓊脂糖溶于0.5×TBE電泳緩沖液中，制成含1.5%的瓊脂糖凝膠。加入溴化乙啶，使終濃度為0.5 μg/mL。取eNOS和GAPDH的PCR產(chǎn)物各5 μL，同6×上樣緩沖液按5∶1混勻，加入樣品孔中，100 V電壓，電泳約60 min。將瓊脂糖凝膠通過(guò)天能凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并分析，計(jì)算出各組織中的eNOS與內(nèi)參照GAPDH灰度的相對(duì)比值(%)。

檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 奈比洛爾對(duì)ADMA損傷的HUVECs上清液NO、NOS活性的影響 與空白對(duì)照組比較，ADMA組作用24 h后，HUVECs上清液NO含量和NOS活性下降(P<0.05)。奈比洛爾孵育后，可劑量依賴(lài)性增加上清液NO濃度和NOS活性。阿替洛爾對(duì)ADMA損傷的HUVECs上清液NO含量和NOS活性無(wú)顯著影響。詳見(jiàn)表1。

2.2 奈比洛爾對(duì)ADMA損傷的HUVECs eNOS mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，ADMA(16 μmol/L)孵育24 h后，HUVECs eNOS mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，奈比洛爾可改善ADMA引起的HUVECse NOS mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，阿替洛爾對(duì)此無(wú)明顯影響。詳見(jiàn)圖1。

表1 奈必洛爾對(duì)ADMA誘導(dǎo)損傷HUVECs上清液NO含量和NOS活性的影響(±s)

M：Marker；1：空白對(duì)照組；2：ADMA組；3：阿替洛爾組；4：奈必洛爾組5 μmol/L；5：奈必洛爾組10 μmol/L；6：奈必洛爾組20 μmol/L。與ADMA 組比較，*P<0.05。

圖1奈必洛爾對(duì)ADMA誘導(dǎo)損傷HUVECs eNOSmRNA表達(dá)的影響

3 討 論

血管內(nèi)皮功能障礙的成因復(fù)雜，NO的生成量減少是其原因之一。ADMA作為一種內(nèi)源性NOS 抑制劑，結(jié)構(gòu)與L-精氨酸相似，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NOS，抑制其活性，從而減少NO生成[3]。血漿中過(guò)高的ADMA水平導(dǎo)致血管舒張功能降低，增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附性，促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，已被列為一種新的心血管疾病危險(xiǎn)因素。研究證實(shí)，體內(nèi)病理生理作用相關(guān)的ADMA濃度(3 μmol/L～16 μmol/L)，就可明顯抑制體外NOS的活性，減少NO的生成[4]。另外，體外實(shí)驗(yàn)表明，ADMA可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，其作用在16 μmol/L最顯著。因此，本研究在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中選用了濃度為16 μmol/L的ADMA損傷HUVECs。結(jié)果顯示，ADMA 16 μmol/L可顯著降低HUVECs上清液NO水平和NOS活性，下調(diào)細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)。ADMA 導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂的可能機(jī)制：①ADMA 導(dǎo)致NOS 活性解偶聯(lián)，不能催化L-精氨酸的雙電子氧化生成NO；②ADMA 在NOS 的活性部位起競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。證實(shí)ADMA是新的心血管疾病預(yù)測(cè)因子。

作為一種新型的選擇性β1受體阻斷劑，奈必洛爾已在國(guó)外應(yīng)用于臨床，1997年首先在德國(guó)上市，1998年又在英國(guó)上市，2007年美國(guó)食品和藥物管理局允許應(yīng)用于輕中度高血壓的治療。而在我國(guó)，奈必洛爾還未真正應(yīng)用于臨床。本課題組對(duì)奈必洛爾進(jìn)行了一些基礎(chǔ)研究，研究發(fā)現(xiàn)奈必洛爾可通過(guò)改善自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)主動(dòng)脈血管反應(yīng)性[5]，減少SHR主動(dòng)脈ADMA的生成，增加動(dòng)脈NO、eNOS蛋白表達(dá)[2]。這說(shuō)明奈必洛爾可通過(guò)減少ADMA生成發(fā)揮血管保護(hù)作用。奈必洛爾可抑制ADMA的縮血管作用[6]，推測(cè)奈必洛爾可以對(duì)抗ADMA誘導(dǎo)的HUVECs損傷。本研究結(jié)果顯示，奈必洛爾濃度依賴(lài)性拮抗ADMA致HUVECs損傷，增加上清液NO水平和NOS活性，上調(diào)eNOSmRNA表達(dá)。

綜上所述，奈必洛爾可有效對(duì)抗ADMA誘導(dǎo)的心血管損傷。但奈必洛爾對(duì)抗ADMA損傷的可能機(jī)制需要進(jìn)一步研究。