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目前，心血管疾病仍然是威脅全球人類健康的主要疾病，是重要的公共衛(wèi)生問題。冠心病的防治及發(fā)病機(jī)制的研究始終是熱點(diǎn)問題[1-3]。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是引起急性心肌梗死(AMI)的主要發(fā)病原因，在動(dòng)物模型研究中，研究者通常將動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死分別造模進(jìn)行研究。然而，在實(shí)際臨床中動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死是并存的，冠心病的防治干預(yù)評估需要同時(shí)關(guān)注其對動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死的綜合影響[4]。因此，很有必要在同一生物體內(nèi)探索建立動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死并存的動(dòng)物雙模型，為中西醫(yī)結(jié)合防治冠心病研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇雄性apoE-/-小鼠，其不同動(dòng)物個(gè)體之間組織差異性較小，行為學(xué)穩(wěn)定。apoE-/-小鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]，SPF級(jí)，體重20 g～25 g，共35只，6周齡。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，共7籠。實(shí)驗(yàn)場地由上海市中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供，SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)管理，室溫(22±1)℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗循環(huán)照明。高脂飲食組30只，第12周時(shí)制備急性心肌梗死模型，繼續(xù)飼養(yǎng)3周至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。普通飲食組5只作為對照組。

1.2 主要儀器和試劑 小動(dòng)物專用吸入麻醉機(jī) VMR：美國MIDMARK集團(tuán)；2%異氟烷：北京眾實(shí)迪創(chuàng)公司；實(shí)驗(yàn)用冷光源 F-150C：RWD；小動(dòng)物心電圖機(jī)：上海玉研；光學(xué)顯微鏡 CX41RF：Olympus；ImageMeasure圖像分析軟件：上海申騰信息技術(shù)有限公司生產(chǎn)等。

1.3 apoE-/-小鼠AS和AMI雙模型的制備 高脂飼料配方：基礎(chǔ)小鼠飼料89.8%、脂肪10%和膽固醇0.15%。第12周術(shù)前1 d禁水、禁食，apoE-/-小鼠根據(jù)Gao等[5]報(bào)道的手術(shù)方法造模。術(shù)前每籠小鼠置于麻醉誘導(dǎo)箱予2%異氟烷氣體誘導(dǎo)麻醉(0.3 mL/min)，并維持小鼠頭套麻醉(見圖1)，待小鼠全部無活動(dòng)后，用脫毛膏涂抹于小鼠胸部脫毛，輕輕按摩并用紗布擦拭脫毛，將小鼠四肢固定于鼠板。冷光源直視條件下，取左胸第四肋間(觀察到心尖搏動(dòng)點(diǎn))做1個(gè)皮膚小切口(約1.2 cm)，逐層剝離胸大肌、胸小肌。

圖A：異氟烷氣體麻醉機(jī)；圖B：頭套異氟烷氣體維持麻醉，脫毛準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

圖1無創(chuàng)麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備

選取心尖搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)用無菌鑷穿破胸膜，擠壓小鼠右側(cè)胸廓及腹部，撐開鑷子，將心臟引導(dǎo)至胸腔外保持。直視條件下找到左前降支(LAD)，于左心耳與心尖連線上，左心耳以下3 mm左右鉗持6-0縫線結(jié)扎LAD，觀察到心尖部心肌組織變白后回納心臟，擠壓胸廓排氣，用4-0縫線縫合肌肉及皮膚(見圖2)。術(shù)中體表心電圖監(jiān)測。置于麻醉清醒籠中待小鼠蘇醒。所有存活小鼠繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)3周，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)頸椎脫位法處死動(dòng)物取材。

圖A：切開皮膚表面，冷光源下觀察心尖搏動(dòng)位置；圖B：無菌鑷突破胸膜腔；圖C：擠壓胸廓和腹腔，“Pop-out”心臟；圖D：直視下觀察LAD；圖E：左心耳以下3 mm帶針縫線穿過心室壁及血管；圖F：縫線結(jié)扎LAD。

圖2結(jié)扎LAD后形成急性心肌梗死

1.4 標(biāo)本取材 處死小鼠后經(jīng)肋弓剪開小鼠胸腔，充分暴露心臟。在腹腔中找到小鼠腹主動(dòng)脈，自下而上用顯微器械鈍性分離小鼠動(dòng)脈上的組織，盡可能不要損傷血管表面。將生理鹽水掛在較高位置，用注射鋼針插入小鼠心室，剪開左心耳，大流量快速?zèng)_洗血管和心臟中殘留的血液，沖洗直至白色透亮的動(dòng)脈顯露。連同心臟一起取下，下端需取至腹主動(dòng)脈下端。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心肌梗死的評價(jià)

1.5.1.1 心肌Evan′s Blue-TTC染色 主動(dòng)脈口用生理鹽水灌注沖去心腔內(nèi)的血液，再灌注0.3%Evans Blue(注射用水配制)；將切片心肌組織置入磷酸緩沖液(pH7.4)中37 ℃水浴10 min～15 min(避光，振蕩)；10%甲醛溶液固定10 min。在同一心臟組織切片上可以看到白色、紅色以及藍(lán)色三色染色，其中壞死區(qū)域無法著色顯示白色，正常組織區(qū)域充分染色顯示紅色，血管染色為藍(lán)色，包繞在外側(cè)。

1.5.1.2 心肌纖維化 4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片；Masson染色鏡下可見肌纖維呈紅色，纖維化改變的結(jié)締組織呈綠色或藍(lán)色著染。分別在心肌梗死區(qū)(染色最深)、梗死邊緣區(qū)(可見紅藍(lán)交界)、正常心肌組織(紅色)區(qū)域拍照對比。

1.5.2 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的評價(jià)

1.5.2.1 主動(dòng)脈大體油紅O染色 標(biāo)本用油紅O染色，使用愛普生掃描儀在玻片覆蓋下掃描染色組織，掃描前充分展開皺縮的血管壁，可在圖像處理軟件下評估斑塊面積。

1.5.2.2 動(dòng)脈切片HE染色 動(dòng)脈橫截面行HE染色，觀察動(dòng)脈粥樣硬化病理改變。

2 結(jié) 果

2.1 造模成功率 高脂飲食組apoE-/-小鼠30只，其中造模術(shù)中死亡3只：1只是因?yàn)榭p針插入過深，出血不止，心臟破裂死亡；1只術(shù)后發(fā)生室性心動(dòng)過速、室性顫動(dòng)死亡；1只是因?yàn)闅庑?，術(shù)后予胸外按壓搶救無效。造模成功率為90%。

2.2 心電圖表現(xiàn) 心電圖可以直觀反映小鼠的實(shí)時(shí)心電活動(dòng)，當(dāng)結(jié)扎LAD后，肢體導(dǎo)聯(lián)ST段上揚(yáng)兩小格，J點(diǎn)位置較術(shù)前明顯上移，符合典型的急性心肌梗死特征性心電圖改變。詳見圖3。

圖3肢體導(dǎo)聯(lián)可明顯發(fā)現(xiàn)ST段(J點(diǎn))抬高(箭頭所指處為改變位置)

2.3 Evans′Blue-TTC染色 取小鼠心臟組織做Evans′Blue-TTC染色。心臟切片上可以顯著區(qū)分梗死區(qū)和正常組織區(qū)。詳見圖4。

2.4 Masson染色 正常組織區(qū)肌纖維排列整齊；而梗死區(qū)壞死組織逐漸被溶解吸收，被增生的纖維組織替代，心室壁變??；在梗死邊緣區(qū)呈現(xiàn)交替的病理改變。詳見圖5。

2.5 主動(dòng)脈弓大體觀測 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，在高倍放大鏡下解剖小鼠，分離主動(dòng)脈弓，在直視條件下可見主動(dòng)脈弓處大量斑塊形成，圖中白色部分為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。詳見圖6。

白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)(→)；紅色區(qū)域?yàn)檎^(qū)(—)；藍(lán)色部分為血流灌注區(qū)包繞心臟()。

圖4 Evans′Blue-TTC染色結(jié)果

A：正常組織區(qū)；B：梗死邊緣區(qū)；C：梗死區(qū)

圖5心肌梗死后3周小鼠Masson染色(10倍)

圖6顯微鏡下解剖小鼠主動(dòng)脈及主動(dòng)脈弓(箭頭所指為斑塊所在位置)

2.6 油紅O染色 可在主動(dòng)脈弓及主動(dòng)脈全程見明顯的斑塊形成，圖中紅色的部分為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。高脂飲食飼養(yǎng)小鼠斑塊陽性面積[(75±7)%]明顯多于普通飲食小鼠[(35±5)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖7。

圖7小鼠主動(dòng)脈全長油紅O染色

2.7 HE染色 主動(dòng)脈全長連續(xù)切片HE染色，可發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮下層明顯增厚，血管內(nèi)壁呈現(xiàn)膽固醇結(jié)晶和泡沫細(xì)胞(較均勻分布的小脂質(zhì)體、著色淺)；普通飲食組動(dòng)脈硬化改變不明顯。詳見圖8。

圖A：高脂飲食組(箭頭所指位置為泡沫細(xì)胞)；圖B：普通飲食組。

圖8小鼠主動(dòng)脈HE染色

3 討 論

AS是導(dǎo)致心肌梗死的最主要原因，臨床上動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死兩種病理狀態(tài)往往是并存的[6]。在缺血性心血管疾病的基礎(chǔ)研究中，高效制備穩(wěn)定且盡可能模擬臨床真實(shí)病理生理狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型尤為重要。apoE-/-小鼠是目前已知曉的AS動(dòng)物模型中制備效果較符合人們期望的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因基因技術(shù)的干預(yù)使apoE-/-小鼠具備遺傳背景的優(yōu)勢，加上高脂飲食喂養(yǎng)，apoE-/-小鼠發(fā)生AS的概率會(huì)大大增加。apoE-/-小鼠存在典型的脂質(zhì)核心和較薄纖維帽結(jié)構(gòu)，與人的斑塊結(jié)構(gòu)相近。但缺點(diǎn)是沒有出現(xiàn)明顯的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，僅在老齡apoE-/-小鼠中可發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病灶出血，斑塊破裂處缺乏纖維蛋白和血栓形成，僅少數(shù)可以形成自發(fā)性心肌梗死[7]。本實(shí)驗(yàn)研究通過高脂飲食飼養(yǎng)apoE-/-小鼠，在異氟烷氣體麻醉下結(jié)扎LAD，制備一種新型AS和AMI的復(fù)合模型。傳統(tǒng)LAD結(jié)扎法制備小鼠心肌梗死模型可能出現(xiàn)以下問題[8-9]：①腹腔注射麻醉劑容易導(dǎo)致小鼠過度麻醉，術(shù)后無法恢復(fù)自主呼吸，使死亡率增高；②由于需要使用呼吸機(jī)機(jī)械通氣，所以必須開放氣道，無論是直視下經(jīng)口腔置入氣管還是暴露氣管環(huán)狀軟骨插管均可能導(dǎo)致氣道、甲狀腺及食管損傷等不良事件；③術(shù)中需逐層暴露小鼠心臟，機(jī)械分離肌肉、胸膜腔和心包腔，手術(shù)時(shí)間長，破壞原有解剖結(jié)構(gòu)，損傷嚴(yán)重，不利于恢復(fù)。2011年Gao等[5]提出一種新型有效制備小鼠心肌梗死模型的方法，其主要特點(diǎn)包括：①異氟烷氣體批量麻醉，小鼠蘇醒快，無需氣管插管；②通過“Pop-out”的方法直視下結(jié)扎LAD，該方法充分利用了生物臟器的可移動(dòng)性，通過擠壓胸廓加上引導(dǎo)的方式將心臟暴露于胸腔外而不至過大損傷，最大限度地減少了手術(shù)操作時(shí)間，降低了死亡率，縮小了創(chuàng)面，并且保留了肌肉之間的解剖關(guān)系，極大地降低了氣胸的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；③相比于傳統(tǒng)方法，新的造模方法具有更好的存活率。本實(shí)驗(yàn)采用上述方法，在冷光源直視條件下直接結(jié)扎LAD，快速安全，術(shù)后無需特殊設(shè)備排氣，因?yàn)槿讨芯脙墒种笖D壓胸廓，減少氣胸的發(fā)生。經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練和技術(shù)改進(jìn)，造模成功率可以達(dá)到90%。

本研究結(jié)果提示，結(jié)扎LAD后體表心電圖提示ST段明顯抬高，符合典型AMI的心電圖表現(xiàn)；心肌梗死手術(shù)后3周，取心臟組織做Evans′Blue-TTC染色，切片上可以明顯區(qū)分梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，正常組織區(qū)呈現(xiàn)紅色；Masson染色發(fā)現(xiàn)，正常心肌組織區(qū)肌纖維排列整齊，而梗死區(qū)呈現(xiàn)凝固性壞死，被增生的纖維組織替代。上述結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有典型的心肌梗死病理特征。apoE-/-小鼠給予高脂飲食飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)取材分離主動(dòng)脈弓及胸主動(dòng)脈，在直視條件下可見主動(dòng)脈弓處大量斑塊形成，尤其主動(dòng)脈根部、頭臂動(dòng)脈及其分支更為明顯；油紅O染色斑塊陽性面積明顯高于普通飲食小鼠；主動(dòng)脈全長連續(xù)切片HE染色，可發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜明顯增厚，斑塊形成明顯，血管內(nèi)壁呈現(xiàn)膽固醇結(jié)晶和泡沫細(xì)胞。上述結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同時(shí)具有典型的動(dòng)脈粥樣硬化病理特征。對apoE-/-小鼠給予高脂飲食和開胸結(jié)扎LAD干預(yù)，可以制備一種新型AS和AMI并存的復(fù)合模型。

2010年課題組首次報(bào)道選用新西蘭兔給予高脂飲食喂養(yǎng)，再通過心導(dǎo)管介入封堵冠狀動(dòng)脈，建立兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死雙模型，用以比較血管新生在動(dòng)脈粥樣硬化和缺血心肌中發(fā)生機(jī)制的研究[10-12]。但是，兔子是草食性動(dòng)物，建模時(shí)的高脂飼養(yǎng)組方和所用時(shí)間不同，使其病變特點(diǎn)亦與人體不同。雖然兔子模型早期的脂肪條紋與人類相似，但是不易形成明顯的組織斑塊，高級(jí)病變的可能性小，而且長期高脂飲食會(huì)造成兔子肝損傷，同時(shí)兔抵抗力差、易繼發(fā)感染，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物死亡率較高。而且，心導(dǎo)管技術(shù)需要大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備的支撐，技術(shù)難度大，操作復(fù)雜，耗時(shí)長。因此，有必要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用和實(shí)踐中醫(yī)的整體理論，基于藥物多靶點(diǎn)作用的思考，通過高脂飲食結(jié)合氣體麻醉下快速結(jié)扎LAD，成功建立apoE-/-小鼠AS和AMI雙模型，更接近人類的疾病狀態(tài)。模型的建立可以同時(shí)為動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死發(fā)病機(jī)制的研究提供平臺(tái)，也為中西醫(yī)結(jié)合藥物多靶點(diǎn)干預(yù)的療效評價(jià)提供平臺(tái)。