李若晨 張靜 楊龍 李國慶

摘要：對生防菌間型假絲酵母（Candida intermedia）C410菌株的液體酵母保存方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明，當(dāng)保存起始細(xì)胞濃度為2×109個(gè)細(xì)胞/mL，4 ℃恒溫保存，在磷酸緩沖液PPB中添加5%海藻糖和1 mmol/L維生素C時(shí)，能夠使C410酵母細(xì)胞保持高效活力持續(xù)90 d以上。對保存90 d的液體酵母防效進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其防治效果與新鮮酵母細(xì)胞懸浮液的防效相當(dāng)，都能抑制番茄灰霉病菌的生長繁殖，保持番茄果實(shí)品質(zhì)完整。

關(guān)鍵詞：灰霉?。簧锓乐?；間型假絲酵母（Candida intermedia）C410；液體酵母

中圖分類號：S436.412.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）16-0066-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.015 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Preservation of Liquid Formulation of the Biocontrol Agent Candida intermedia C410

LI Ruo-chen，ZHANG Jing，YANG Long，LI Guo-qing

（College of Plant Science & Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： The preservation of liquid formulation of the biocontrol agent Candida intermedia C410 was primarily explored. Results showed that， while the initial preserving concentration was 2×109 cells/mL， storage temperature was 4 ℃， liquid formulation of C410 with high viability of cells were phosphate buffers supplemented with 5% trehalose and 1 mmol/L ascorbic acid. The liquid formulation kept high viability of yeast cells for more than 90 days. Suspensions of liquid formulation after 90 days and fresh yeast cells were tested against B. cinerea on tomato fruits， both suspensions exhibited prospective biocontrol effect， gray mould of tomato was inhibited while the quality of tomato fruits maintain completely good.

Key words： gray mold； biocontrol； Candida intermedia C410； liquid formulation

酵母菌是一類結(jié)構(gòu)簡單的單細(xì)胞微生物，廣泛存在于自然生態(tài)系統(tǒng)中，如植物的葉片、花瓣、果實(shí)表面、土壤及植物根圍、腐爛的植物組織、海洋等生態(tài)環(huán)境中。人類對酵母菌的開發(fā)利用可以追溯至 4 000年前，至今在多個(gè)領(lǐng)域有生產(chǎn)應(yīng)用[1]。利用酵母菌作為生防因子來防治植物病害的發(fā)生與蔓延是近年來國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，迄今已發(fā)現(xiàn)了30多種酵母菌能夠有效生防辣椒、番茄、葡萄、草莓、桃、柑橘等果蔬上由不同病原菌引起的腐爛[2-6]。

酵母菌作為生防菌的潛力已被研究者深入試驗(yàn)評估，但其商業(yè)化應(yīng)用發(fā)展較為緩慢，目前主要有液體酵母和干酵母兩類制劑。制劑“Aspire”主要成分為Candida oleophila I-182，以Cryptococcus albidus為基礎(chǔ)制成Yield Plus，將Metschnikowia fructicola商業(yè)化為Shemer等，這些制劑主要作為保鮮劑對果蔬進(jìn)行保鮮處理。

前人研究證明間型假絲酵母（Candida intermedia）C410菌株對貯藏期草莓果實(shí)灰霉病有明顯的防治效果[7，8]。通過室內(nèi)防效、保護(hù)地防效評估發(fā)現(xiàn)生防菌C410對番茄灰霉病有一定的防病潛力，該生防菌田間噴霧處理減輕了保護(hù)地番茄灰霉病病害的發(fā)生[9]。同時(shí)在番茄植株盛花期，低濃度和高濃度C410細(xì)胞懸浮液花瓣噴霧處理后，酵母細(xì)胞能適應(yīng)保護(hù)地環(huán)境，在花瓣微環(huán)境中占有一定的空間優(yōu)勢，可以存活5 d以上直至花瓣凋落[9]。因此可以將間型假絲酵母C410菌株研發(fā)制備成生物菌劑在田間推廣應(yīng)用。

液體酵母是生防菌劑制備的理想劑型，方法簡單，容易操作，酵母細(xì)胞有效成分在制備過程中損失較少。前人制備Candida sake和Pichia anomala的液體酵母時(shí)在磷酸緩沖液中添加海藻糖或乳糖使酵母細(xì)胞能夠保持高效活力[10，11]。本試驗(yàn)以C410酵母細(xì)胞為有效菌劑成分，篩選適合酵母細(xì)胞存活的液體酵母保存方法，并對保存的液體酵母生防穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株培養(yǎng) 將經(jīng)活化后新培養(yǎng)的灰霉病菌（Botrytis cinerea）的新鮮菌絲塊轉(zhuǎn)至PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）平板中央，20 ℃黑暗培養(yǎng) 14 d，得到試驗(yàn)用分生孢子。

酵母菌株C410細(xì)胞保存于20%甘油中，-80 ℃儲(chǔ)存。使用前用接種環(huán)蘸取少許菌液劃線于YPDA（酵母提取浸粉蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）平板上進(jìn)行活化（20 ℃，3～5 d），新鮮菌體再轉(zhuǎn)入100 mL YPD液體培養(yǎng)基20 ℃，搖培3 d作為種子發(fā)酵液待用。

1.1.2 C410細(xì)胞懸浮液的制備 從100 mL YPD（酵母提取浸粉蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)液）液體培養(yǎng)基中吸取200 μL C410種子發(fā)酵液至YPDA平板上，用涂布器涂勻吹干后20 ℃黑暗培養(yǎng)發(fā)酵，3 d后將平板上的酵母細(xì)胞用滅菌水洗下，即為C410細(xì)胞懸浮液。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 1）PDA：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂14 g，去離子水1 000 mL。

2）YPDA：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取浸粉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

3）YPD：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取浸粉10 g，去離子水1 000 mL。

4）PPB（磷酸緩沖液）：1 mol/L K2HPO4 27.8 mL，1 mol/L KH2PO4 72.2 mL，混合均勻后稀釋至50 mmol/L。

5）維生素C（抗壞血酸）：1.76 g粉劑溶于100 mL去離子水，并用細(xì)菌過濾器進(jìn)行過濾處理，最后根據(jù)試驗(yàn)處理進(jìn)行梯度稀釋至1 mmol/L。

6）其他試劑：甘油、海藻糖。

1.2 方法

1.2.1 液體酵母有效成分酵母菌體的獲取 制備C410細(xì)胞懸浮液，于4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，棄上清并將酵母細(xì)胞重懸浮于50 mmol/mL磷酸緩沖液PPB（pH 6.4）中，清洗后4 ℃條件下8 000 r/min再次離心10 min，棄上清，得到液體酵母制備所需有效成分酵母菌體。

1.2.2 液體酵母保存濃度的確定 將離心得到的酵母菌體重懸浮于下列不同處理中，①對照PPB；②含10%甘油的PPB；③含20%甘油的PPB；④含10%甘油及維生素C（1 mmol/L）的PPB；⑤含20%甘油及維生素C（1 mmol/L）的PPB；⑥含1%海藻糖的PPB；⑦含5%海藻糖的PPB；⑧含1%海藻糖及維生素C（1 mmol/L）的PPB；⑨含5%海藻糖及維生素C（1 mmol/L）的PPB。

利用血球計(jì)數(shù)板將上述各處理的酵母細(xì)胞起始保存濃度調(diào)整至2×109個(gè)細(xì)胞/mL和2×1010個(gè)細(xì)胞/mL，置于20 ℃培養(yǎng)箱恒溫保存。10 d后分別對各處理進(jìn)行取樣梯度稀釋，用移液器分別取200 μL稀釋樣品涂于YPDA培養(yǎng)基平板上，超凈工作臺(tái)中吹干后置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后對平板中的酵母菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 液體酵母保存溫度的確定 液體酵母各處理方法同“1.2.2”，利用血球計(jì)數(shù)板將各處理的酵母細(xì)胞起始保存濃度調(diào)整至2×109個(gè)細(xì)胞/mL，分別置于4 ℃和20 ℃恒溫保存，10、30、90 d后分別對各處理進(jìn)行取樣梯度稀釋。取200 μL稀釋樣品涂于YPDA培養(yǎng)基平板上，超凈工作臺(tái)中吹干，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后對平板中的酵母菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 液體酵母儲(chǔ)存90 d后的防效檢測 對儲(chǔ)存90 d的液體酵母取樣稀釋，利用血球計(jì)數(shù)板將各處理液體酵母細(xì)胞濃度調(diào)至3×107個(gè)細(xì)胞/mL；同時(shí)制備培養(yǎng)3 d的新鮮C410細(xì)胞懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板使其細(xì)胞濃度達(dá)到3×107個(gè)細(xì)胞/mL。用去離子水將培養(yǎng)14 d的灰葡萄孢分生孢子從培養(yǎng)基平板上洗下，并用兩層擦鏡紙過濾，借助血球計(jì)數(shù)板將其調(diào)至終濃度2×106個(gè)孢子/mL后備用。

從超市購買新鮮的紅櫻桃番茄，去離子水清洗表面，并用75%乙醇表面消毒30 s，然后用去離子水漂洗3次去除殘留乙醇，最后將番茄果實(shí)置于吸水紙上自然晾干。在每一番茄表面中心處制造長2 mm、寬2 mm、深2 mm的人工傷口，將直徑5 mm滅菌濾紙片浸蘸下列不同的C410酵母細(xì)胞懸浮液后覆蓋于番茄傷口處：①新鮮酵母細(xì)胞懸浮液（FC）；②5%海藻糖儲(chǔ)存90 d的液體酵母（5%T）；③5%海藻糖及維生素C（1 mmol/L）儲(chǔ)存90 d的液體酵母（5%T+Vc）；④對照處理（CK）。用移液器滴加20 μL配制好的灰霉分生孢子液于濾紙片上，每處理20個(gè)番茄果實(shí)，重復(fù)2次，對照處理為覆蓋僅滴加20 μL灰霉分生孢子液的濕潤濾紙片。

將處理好的番茄置于鋪有濕潤吸水紙的塑料盒內(nèi)，封口后將盒子置于20 ℃培養(yǎng)箱，7 d后觀察記錄結(jié)果。根據(jù)各果實(shí)發(fā)病情況，將單果發(fā)病程度依9個(gè)等級分別進(jìn)行記錄，分級標(biāo)準(zhǔn)如下[7]。0級，果實(shí)完全不發(fā)病；1 級，發(fā)病面積≤整果面積的1/8；2級，發(fā)病面積≤整果面積的1/4；3級，發(fā)病面積≤整果面積的3/8；4級，發(fā)病面積≤整果面積的1/2；5級，發(fā)病面積≤整果面積的5/8；6級，發(fā)病面積≤整果面積的3/4；7級，發(fā)病面積≤整果面積的7/8；8級，整果發(fā)病。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分別對上述試驗(yàn)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）。采用Duncan氏新復(fù)極差法比較各試驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 C410液體酵母保存濃度的測定

20 ℃恒溫保存10 d，不同保存濃度下各處理的C410液體酵母細(xì)胞存活數(shù)量呈現(xiàn)不同態(tài)勢（表1）。當(dāng)起始保存濃度為2×109個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，各處理中添加甘油保護(hù)劑的液體酵母活細(xì)胞數(shù)量下降一個(gè)數(shù)量級至108個(gè)細(xì)胞/mL，混合添加甘油和維生素C的液體酵母活細(xì)胞數(shù)量同樣下降到108個(gè)細(xì)胞/mL，而添加1%、5%海藻糖或添加1%、5%海藻糖及1 mmol/L 維生素C的處理液體酵母活細(xì)胞數(shù)量仍能維持在109個(gè)細(xì)胞/mL數(shù)量級，添加5%海藻糖及1 mmol/L維生素C的C410液體酵母細(xì)胞存活率為90%，顯著高于其他處理。當(dāng)起始保存濃度為2×1010個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，未發(fā)現(xiàn)較好處理使酵母活細(xì)胞數(shù)量能維持1010個(gè)細(xì)胞/mL數(shù)量級，各處理酵母活細(xì)胞數(shù)量都下降一個(gè)數(shù)量級，C410液體酵母細(xì)胞存活率較低。

2.2 C410液體酵母細(xì)胞保存溫度的測定

采用2×109個(gè)細(xì)胞/mL起始保存濃度對各處理進(jìn)行保存溫度的研究。由表2可知，20 ℃恒溫保存時(shí)，單獨(dú)添加甘油保護(hù)劑的處理和混合添加甘油、維生素C的處理中C410液體酵母細(xì)胞存活狀態(tài)較差，保存10 d C410液體酵母活細(xì)胞數(shù)量由2×109個(gè)細(xì)胞/mL下降至108個(gè)細(xì)胞/mL數(shù)量級，保存30 d C410液體酵母活細(xì)胞數(shù)量下降至107個(gè)細(xì)胞/mL數(shù)量級，最高存活率只有1.6%，YPDA平板上能長出絲狀真菌菌落或細(xì)菌菌落。保存90 d各處理污染較嚴(yán)重，未檢測。相同處理在4 ℃恒溫保存時(shí)C410液體酵母細(xì)胞存活相對20 ℃恒溫保存情況較好，保存10和30 d活細(xì)胞數(shù)量仍能穩(wěn)定維持在2×109個(gè)細(xì)胞/mL左右，保存90 d液體酵母細(xì)胞存活數(shù)量出現(xiàn)下滑，C410液體酵母活細(xì)胞數(shù)量下降至108個(gè)細(xì)胞/mL數(shù)量級。

相比甘油保護(hù)劑配方，單獨(dú)添加海藻糖或混合添加海藻糖、維生素C能使C410液體酵母細(xì)胞存活更好。20 ℃恒溫保存10 d，各處理能檢測到109個(gè)細(xì)胞/mL以上C410液體酵母活細(xì)胞，保存30 d只添加1%海藻糖的處理檢測到9.8×108個(gè)細(xì)胞/mL左右活細(xì)胞，而其他處理液體酵母活細(xì)胞數(shù)量在109個(gè)細(xì)胞/mL以上。最高C410液體酵母細(xì)胞存活率為80%，與其他處理相比差異顯著，YPDA平板上部分處理能檢測到絲狀真菌菌落。4 ℃恒溫保存時(shí)，10 d C410液體酵母菌能保持接近100%的存活率，存活的酵母菌濃度與起始保存濃度2×109個(gè)細(xì)胞/mL相當(dāng)，保存30和90 d單獨(dú)添加海藻糖或混合添加海藻糖、維生素C的處理C410液體酵母活細(xì)胞數(shù)量可以維持在1.5×109個(gè)細(xì)胞/mL以上，細(xì)胞存活率80%以上。

2.3 C410液體酵母儲(chǔ)存90 d的防效

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，單獨(dú)添加5%海藻糖或混合添加5%海藻糖及1 mmol/L維生素C顯示出保存酵母活細(xì)胞的優(yōu)勢，因此比較這兩種液體酵母儲(chǔ)存90 d對番茄灰霉病的防治效果。

如圖1所示，接種7 d，對照（CK）只滴加灰霉分生孢子液的番茄果實(shí)在接種點(diǎn)周圍長滿灰白色菌絲，部分可見灰色分生孢子形成，番茄果皮暗紅色，果實(shí)變軟塌陷，平均病情嚴(yán)重度達(dá)到3.6；單獨(dú)添加5%海藻糖（5%T）或混合添加5%海藻糖及1 mmol/L維生素C（5%T+VC）的液體酵母滴加至番茄果實(shí)上后，接種點(diǎn)處未見大量灰色菌絲形成，少數(shù)傷口處呈黃褐色壞死狀，果實(shí)幾乎不發(fā)病，與新鮮酵母細(xì)胞懸浮液（FC）的防效相當(dāng)，平均病情嚴(yán)重度小于1.0。

3 討論

干酵母制劑和液體酵母是兩種重要的保存酵母細(xì)胞活力的制備劑型，干酵母貨架期長久，可以使酵母細(xì)胞活力保持2年之久，耐高溫儲(chǔ)存，污染概率較小，但脫水和復(fù)水過程造成大量有效成分酵母細(xì)胞的死亡[12，13]；液體酵母制備方法簡單，操作簡易，制備過程中酵母細(xì)胞有效成分損失較少，是理想的生防菌劑制備劑型。

前人研究中，制備液體酵母時(shí)在磷酸緩沖液中添加海藻糖或乳糖能夠使Candida sake和Pichia anomala的酵母細(xì)胞保持高效活力[10，11]。本試驗(yàn)篩選出了對C410酵母細(xì)胞存活影響較小的保存方法，當(dāng)保存起始細(xì)胞濃度為2×109個(gè)細(xì)胞/mL，保存溫度為4 ℃恒溫，單獨(dú)添加5%海藻糖或混合添加5%海藻糖和1 mmol/L維生素C酵母活細(xì)胞數(shù)量可以維持在1.5×109個(gè)細(xì)胞/mL以上，適合制備酵母菌劑。

海藻糖可以作為生物制品制備中的優(yōu)良保護(hù)劑，在胞外可在酵母細(xì)胞表面形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效保護(hù)細(xì)胞膜上的蛋白分子使其避免失活變性，維持正常功能運(yùn)作；在細(xì)胞內(nèi)部，海藻糖可以增加細(xì)胞質(zhì)的黏稠度，改變胞內(nèi)水勢，延緩細(xì)胞代謝，使細(xì)胞穩(wěn)定存活[14]。本研究中添加5%海藻糖提高了C410酵母細(xì)胞的存活能力。

液體酵母保存過程中活性氧的生成是影響酵母細(xì)胞存活的重要因子，抗壞血酸（維生素C）是重要的抗氧化劑，在食品工業(yè)中作為食品添加劑廣泛應(yīng)用。在本研究中添加5%海藻糖同時(shí)混合1 mmol/L維生素C可延長酵母細(xì)胞存活時(shí)間，4 ℃恒溫保存90 d，酵母存活率維持在100%左右，180 d后還能檢測到109個(gè)細(xì)胞/mL的酵母活細(xì)胞，這可能與維生素C消除制劑中的活性氧保護(hù)細(xì)胞不受損害有關(guān)。生防制劑最終將應(yīng)用到大田，紫外線傷害會(huì)阻礙生防因子的田間存活，維生素C能夠作為紫外線保護(hù)劑提高生防菌種群在田間的存活能力，因此有必要在液體酵母中添加維生素C消除制劑中的活性氧同時(shí)減少田間紫外線的傷害。因此，混合添加5%海藻糖及1 mmol/L維生素C的配方優(yōu)于單獨(dú)添加5%海藻糖的處理。

單獨(dú)添加5%海藻糖或混合添加5%海藻糖及1 mmol/L維生素C的優(yōu)勢液體酵母儲(chǔ)存90 d的酵母菌對番茄灰霉病的防治效果顯示，這兩種方式保存的液體酵母防治效果與新鮮酵母細(xì)胞懸浮液的防效相當(dāng)，均能抑制番茄灰霉病菌的生長繁殖，保持番茄果實(shí)品質(zhì)完整。田間存在各種復(fù)雜的環(huán)境因素，后期有必要對優(yōu)勢處理的田間防效穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)檢測，為酵母菌C410田間應(yīng)用提供有效參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[2] HA？魵SSAM J M. Pichia anomala in biocontrol for apples： 20 years of fundamental research and practical applications[J].Anton Leeuw，2011，99：93-105.

[3] ZHAO Y，WANG R L，TU K，et al. Efficacy of preharvest spraying with Pichia guilliermondii on postharvest decay and quality of cherry tomato fruit during storage[J].Afr J Biotechnol，2011，10（47）：9613-9622.

[4] ZHANG C F，CHEN K S，WANG G L. Combination of the biocontrol yeast Cryptococcus laurentii with UV-C treatment for control of postharvest diseases of tomato fruit[J].Bio Control，2013，58（2）：269-281.

[5] GUO J，F(xiàn)ANG W W，LU H P，et al. Inhibition of green mold disease in mandarins by preventive applications of methyl jasmonate and antagonistic yeast Cryptococcus laurentii[J].Postharvest Biol Tec，2014，88：72-78.

[6] LONG C A，YUAN G. Kloeckera apiculata strain（34-9） to control Botrytis cinerea during the pre- and postharvest handling of strawberries[J].Ann Microbiol，2009，59（1）：77-81.

[7] 黃 蓉.防治草莓灰霉病酵母菌株篩選及防病機(jī)制研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[8] HUANG R，LI G Q，ZHANG J，et al. Control of postharvest botrytis fruit rot of strawberry by volatile organic compounds of Candida intermedia[J].Phytopathology，2011，101（7）：859-869.

[9] 李若晨.間型假絲酵母C410防治番茄灰霉病的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[10] MELIN P，H？魡KANSSON S，EBERHARD T H，et al. Survival of the biocontrol yeast Pichia anomala after long term storage in liquid formulations at different temperatures， assessed by flow cytometry[J].J Appl Microbiol，2006，100（2）：264-271.

[11] TORRES R，USALL J，TEIXIDO N，et al. Liquid formulation of the biocontrol agent Candida sake by modifying water activity or adding protectants[J].J Appl Microbiol，2003，94（2）：330-339.

[12] LI B Q，TIAN S P. Effects of trehalose on stress tolerance and biocontrol efficacy of Cryptococcus laurentii[J].J Appl Microbiol，2006，100（4）：854-861.

[13] MELIN P，H？魡KANSSON S，SCHN？譈RER J. Optimisation and comparison of liquid and dry formulations of the biocontrol yeast Pichia anomala J121[J].Appl Microbiol Biot，2007，73：1008-1016.

[14] ABADIAS M，USALL J，TEIXIDO N，et al. Liquid formulation of the postharvest biocontrol agent Candida sake CPA-1 in isotonic solutions[J].Phytopathology，2003，93：436-442.