林英 張海東 謝瑾卉 劉欣宇 臧超群 于舒怡 黃玉茜 梁春浩

摘要：開(kāi)展了3個(gè)不同抗性花生品種經(jīng)花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）脅迫后O2-、MDA含量和防御酶系含量變化的測(cè)定，分析其與品種抗病性的相關(guān)性。結(jié)果表明，供試花生品種接種褐斑病菌1～15 d內(nèi)，O2-和MDA含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。對(duì)O2-含量而言，粵油7號(hào)9 d達(dá)到最大值，花育20號(hào)7 d達(dá)到最大值，魯花11號(hào)5 d達(dá)到最大值；對(duì)MDA含量而言，粵油7號(hào)9 d達(dá)到最大值，花育20號(hào)9 d達(dá)到最大值，魯花11號(hào)13 d達(dá)到最大值。接種病菌后葉片中CAT、SOD、POD、PAL和PPO的含量對(duì)比分析表明，魯花11號(hào)最高，花育20號(hào)次之，粵油7號(hào)最低；3種花生品種受侵染后病情指數(shù)與防御酶含量均呈負(fù)相關(guān)，且SOD及PAL含量在抗病品種和感病品種間存在顯著差異。表明花生褐斑病菌侵染后，葉片內(nèi)氧陰離子及MDA暴發(fā)時(shí)間和含量變化與花生品種抗性密切相關(guān)，抗性越強(qiáng)的花生品種應(yīng)答時(shí)間越迅速，葉片細(xì)胞遭受破壞越小，細(xì)胞功能喪失越少；不同花生品種對(duì)褐斑病抗性水平存在差異，褐斑病菌脅迫可引起花生葉片防御酶活性及抗氧化物質(zhì)含量變化，且抗性越強(qiáng)的花生品種防御酶含量越高；SOD和PAL含量可作為鑒定花生對(duì)褐斑病抗性的生理生化指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）；不同抗性；活氧代謝；防御酶

中圖分類號(hào)：S435.652 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）16-0051-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.16.012 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Cercospora arachidicola Infection on Active Oxygen Metabolism and Defense Enzymes Changes in Peanut Varieties with Different Resistance

LIN Ying1，ZHANG Hai-dong1，XIE Jin-hui1，LIU Xin-yu2，ZANG Chao-qun1，

YU Shu-yi1，HUANG Yu-qian2，LIANG Chun-hao1

（1.Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China；2.Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Abstract： Three varieties of peanut varieties with different resistant peanut varieties were determined by the changes of O2-， MDA content and defense enzyme content after the stress of Cercospora arachidicola，and the correlation between them and the disease resistance was analyzed. The results showed that the peanut variety tested bacteria inoculated leaf spot within 1～15 d，O2- and MDA content were presented increased first and then decreased trend. Among them， for the content of O2-， Yueyou No.7 reached maximumafter 9 d，and Huayu No.20 reached maximum after 7 d， and Luhua No.11 reached maximum after 5 d；For the content of MDA，Yueyou No.7 peaked after 9 d， Huayu No.20 reached a maximum peak after 9 d， Luhua No.11 reached the maximum after 13 d. The comparative analysis of CAT，SOD，POD，PAL and PPO in the leaves after inoculation showed that Luhua No.11 was the highest， followed by the Huayu No.20， and the lowest in Yueyou No.7. There was a negative correlation between the disease index and the protective enzyme content of the three kinds of peanut varieties，and there was a significant difference between the SOD and the PAL content in disease-resistant cultivars and susceptible varieties. Indicated that the peanut leaf spot after bacteria infection， oxygen anion and outbreak time and MDA content in leaf change were closely related to the resistance of peanut varieties， the stronger the resistance of peanut varieties response time more quickly， the smaller the leaf cell damage，and cell function lost the less； Different peanut varieties for leaf spot resistance level differences， rhizoctonina bacteria stress could cause the peanut leaf defense enzymes and antioxidants content changes， and the stronger the resistance of peanut varieties defense enzyme content was higher； The content of SOD and PAL could be used as the physiological and biochemical indexes to identify the resistance of peanut to C. arachidicola.

Key words： Cercospora arachidicola Hori； different resistance； active oxygen metabolism； defense enzymes

花生褐斑病是危害最廣的花生葉部病害之一[1-3]，嚴(yán)重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病在始花期發(fā)病，初期形成黃褐色針頭狀病斑，后期形成圓形或不規(guī)則形暗褐色病斑，病斑周圍伴有黃色退綠暈圈。在花生生育后期，病重葉片可產(chǎn)生大量病斑，且病斑相連，常導(dǎo)致葉片枯死提前脫落，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致花生減產(chǎn)可達(dá)30%以上[4]。

活性氧是分子態(tài)氧（O2）還原以后產(chǎn)生活性態(tài)氧的總稱[5]。植物組織遭受真菌侵染時(shí)，會(huì)導(dǎo)致某階段呼吸作用提高，活性氧的產(chǎn)生速率增大[6]。研究表明，隨著活性氧在體內(nèi)積累，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物增加，植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能就會(huì)受到損傷，甚至導(dǎo)致死亡，而防御酶系與活性氧清除密切相關(guān)，在植物體抗氧化功能中處于核心地位[7-9]。因此，活性氧代謝物質(zhì)含量和防御酶含量的高低在一定程度上影響植株的抗侵染能力[10-12]。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)不同抗性花生品種接種褐斑病菌后，其體內(nèi)活氧代謝水平和防御酶變化，以及二者與花生品種抗性的相關(guān)性研究報(bào)道。為此，針對(duì)這一問(wèn)題開(kāi)展了系統(tǒng)研究，以明確褐斑病菌侵染后對(duì)花生活性氧代謝水平和防御酶系活性變化，分析上述兩類植物抗氧化指標(biāo)與花生品種抗病性之間的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示花生抗褐斑病機(jī)理和花生抗褐斑病品種選育提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）HS-01。病害標(biāo)樣采自遼寧省花生主產(chǎn)區(qū)阜新市阜蒙縣，經(jīng)單孢分離、純化和柯赫氏法則驗(yàn)證后于實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試花生品種

高感品種粵油7號(hào)（HS）、抗病品種花育20號(hào)（R）和高抗品種魯花11號(hào)（HR），以上花生品種均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所提供，并在室內(nèi)、田間接種對(duì)其抗性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 菌懸液的制備

將供試菌株HS-01接種于細(xì)燕麥培養(yǎng)基，置于25 ℃培養(yǎng)箱中，光暗交替培養(yǎng)25 d擴(kuò)繁。用無(wú)菌水洗脫病菌孢子，配制成1×105個(gè)孢子/mL懸浮液。每毫升菌懸液中加入0.1%Tween-20，用于增加病菌孢子與葉片的黏附性；每毫升菌懸液中加入0.05 mg蔗糖，以提高孢子萌發(fā)率。

1.4 接種體培育

將草炭土與花生種植田土壤按照1∶3比例混勻，160 ℃高溫滅菌處理30 min，置于內(nèi)徑15 cm塑料花盆中，每盆種植3穴，每穴種植1?；ㄉN子，每個(gè)品種種植30盆。置于12 h光暗交替、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期澆水，觀察花生出苗和生長(zhǎng)情況。

1.5 室內(nèi)人工接種

待花生生長(zhǎng)至始花期，供試品種選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的20盆作為接種體，每盆隨機(jī)選擇2穴噴施褐斑病菌孢子懸浮液5 mL，1穴噴施等量的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，利用6號(hào)透明自封袋保濕，繼續(xù)置于12 h光暗交替、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 樣品前處理

接種1～15 d內(nèi)，每間隔24 h采集相同部位成熟葉片，置于6號(hào)自封袋內(nèi)，標(biāo)注采樣品種與日期。將采集的樣品利用液氮處理10 s后，置于-80 ℃超低溫冰柜中備用。

1.7 不同抗性花生接種褐斑病菌后活氧代謝（O2-）和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

取出每個(gè)處理的花生葉片，用無(wú)菌濾紙吸干水分，剪碎后稱取1 g，置于預(yù)冷的研缽中，加入3 mL 10%三氯乙酸和適量石英砂，冰浴研磨成勻漿，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液用于O2-產(chǎn)生速率和MDA含量的測(cè)定。O2-含量測(cè)定參照陳蓮等[13]的方法，MDA含量測(cè)定參照趙世杰等[14]的方法。

1.8 不同抗性花生品種接種褐斑病菌后防御酶系的測(cè)定

取出每個(gè)處理的花生葉片，用無(wú)菌濾紙吸干水分，剪碎后稱取1 g，置于預(yù)冷的研缽中，加入3 mL PBS緩沖液（0.2 mmol/L，pH 7.8，內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇，1 mmol/L EDTA、PVP少許），再加入適量石英砂，冰浴研磨成勻漿，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，去沉淀取上清液，-20 ℃冰柜中保存。PAL、POD、PPO和CAT含量測(cè)定參照薛應(yīng)龍[15]的方法，SOD含量測(cè)定參照湯章城等[16]的方法。

1.9 不同抗性花生品種發(fā)病情況調(diào)查

接種褐斑病菌15 d后，調(diào)查供試品種的發(fā)病情況。每個(gè)品種隨機(jī)抽取10株，統(tǒng)計(jì)每株葉數(shù)和各級(jí)病葉數(shù)，計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)調(diào)查方法為每次隨機(jī)取30片復(fù)葉，按照其中每一單葉片表面病斑面積占整個(gè)單葉片面積的百分率把發(fā)病程度分為6級(jí)。0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積<10%；2級(jí)，10%≤病斑面積<25%；3級(jí)，25%≤病斑面積<50%；4級(jí)，50%≤病斑面積<75%；5級(jí)，病斑面積≤75%。

病情指數(shù)=■×100%

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性花生品種接種褐斑病菌后葉片O2-含量和MDA含量的變化

由圖1可知，接種后1～15 d，3個(gè)花生品種葉片O2-含量總體上均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)?；浻?號(hào)的O2-含量在接種9 d達(dá)到最大值（df=23，F(xiàn)=88.970，P>0.005），隨后迅速下降后持續(xù)保持在同一水平?；ㄓ?0號(hào)于7 d達(dá)到最大值（df=23，F(xiàn)=54.567，P>0.005），魯花11號(hào)于5 d達(dá)到最大值（df=23，F(xiàn)=6.653，P>0.005）。

由圖2可以看出，在接種花生褐斑菌1～15 d，MDA含量粵油7號(hào)和花育20號(hào)均于9 d達(dá)到最大值（df=23，F(xiàn)=12.806，P>0.005；df=23，F(xiàn)=0.298，P>0.005），魯花11號(hào)MDA含量變化不明顯?；浻?號(hào)峰值明顯高于花育20號(hào)和魯花11號(hào)。由上述結(jié)果可見(jiàn)，花生褐斑病菌侵染后，葉片內(nèi)氧陰離子及MDA暴發(fā)時(shí)間和含量變化與花生品種抗性密切相關(guān)。

2.2 不同抗性花生品種接種褐斑病菌后防御酶系的變化

2.2.1 不同抗性花生接種褐斑病菌后CAT、SOD和POD的變化 由圖3A可見(jiàn)，在接種花生褐斑病菌后，隨著時(shí)間的增加，不同花生品種葉片中CAT含量存在顯著差異，且出現(xiàn)最高峰的時(shí)間存在差異，魯花11號(hào)最高峰出現(xiàn)于5 d（df=23，F(xiàn)=6.653，P>0.005），此時(shí)花生葉片中CAT含量明顯高于粵油7號(hào)（df=11，F(xiàn)=3.525，P>0.005），花育20號(hào)的最高峰出現(xiàn)在9 d（df=23，F(xiàn)=54.567，P>0.005），粵油7號(hào)出現(xiàn)高峰的時(shí)間相對(duì)滯后，出現(xiàn)在15 d（df=23，F(xiàn)=88.970，P>0.005）。

由圖3B可見(jiàn)，在接種花生褐斑病菌后，不同花生品種葉片中SOD含量的變化均呈現(xiàn)出先小幅上升后下降再上升的波浪式變化，3個(gè)花生品種葉片中SOD含量均于接種后1～3 d小幅度上升，于5 d大幅度上升并到達(dá)峰值（161.88、150.21和139.43 U/（g·min））后急劇下降，粵油7號(hào)在接種后1～5 d大幅度上升達(dá)到峰值（137.91），于9 d含量下降后繼續(xù)上升，3個(gè)花生品種均于接種后5 d達(dá)到最大峰值。在整個(gè)試驗(yàn)歷程中，魯花11號(hào)葉片內(nèi)的SOD含量均高于粵油7號(hào)和花育20號(hào)。

由圖3C可見(jiàn)，在接種花生褐斑病菌后，不同花生品種葉片中POD含量的變化呈現(xiàn)先下降后上升再下降后又上升的趨勢(shì)，供試花生品種均在接種后7 d達(dá)到峰值（151.88、133.96和118.33 U/（g·min）），隨后呈下降趨勢(shì)，魯花11號(hào)的下降幅度最小，粵油7號(hào)的下降幅度最大，并于接種后11 d出現(xiàn)不同程度的上升。表明花生褐斑病侵染花生葉片后，活性氧清除體系防御酶的含量變化與花生品種抗性密切相關(guān)。

2.2.2 不同抗性花生接種褐斑病菌后PAL和PPO的變化 由圖4A可知，在接種花生褐斑病菌后1～15 d，供試花生品種葉片中PAL的含量波動(dòng)范圍較小，魯花11號(hào)葉片中PAL的含量明顯高于粵油7號(hào)，并于15 d達(dá)到最大值；接種后，花育20號(hào)葉片中PAL的含量介于魯花20號(hào)和粵油7號(hào)葉片中PAL含量的中間值，持續(xù)波動(dòng)；粵油7號(hào)葉片中PAL含量總體上相對(duì)較少。

同時(shí)，在接種花生褐斑病菌后，魯花11號(hào)和花育20號(hào)葉片內(nèi)PPO的含量有明顯上升，并于7 d達(dá)到最大峰值（df=23，F(xiàn)=0.790，P>0.005；df=23，F(xiàn)=1.597，P>0.005），此后持續(xù)下降，且花育20號(hào)葉片中PPO的含量明顯低于魯花11號(hào)（df=11，F(xiàn)=95.553， P>0.005）?；浻?號(hào)葉片中PPO含量保持小幅度的上升趨勢(shì)，并于接種后15 d達(dá)到最大值（df=23，F(xiàn)=2.056，P>0.005）（圖4B）。

2.3 不同抗性花生品種發(fā)病情況與葉片防御酶活性的相關(guān)性分析

由表1可知，魯花11號(hào)病情指數(shù)最小，屬高抗品種；而粵油7號(hào)發(fā)病嚴(yán)重，屬高感品種；花育20號(hào)發(fā)病程度介于兩者之間，屬于抗病品種?；ㄉ芎职卟【秩竞?，葉片中5種防御酶活性的大小與花生品種抗性密切相關(guān)?；ㄉ共⌒栽綇?qiáng)，病情指數(shù)越低，其防御酶的活性值越高。其中，對(duì)不同抗病性水平花生SOD和PAL的最大活性值與花生葉片受褐斑病菌脅迫后15 d病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)分別為-1.000和-0.998，呈顯著負(fù)相關(guān)。而不同品種間葉片中CAT、POD和PPO含量也均存在差異。

3 小結(jié)與討論

本研究對(duì)不同抗性花生品種接種褐斑病菌后活性氧代謝及葉片內(nèi)防御酶含量的變化進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果表明，不同花生品種對(duì)于褐斑病菌的抗感性與接種后葉片產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物含量及防御酶的含量密切相關(guān)。

病原菌侵染誘導(dǎo)植物組織積累活性氧以抑制病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，使得活性氧積累在植物抗病防御反應(yīng)中起重要作用，這是植物與病原菌響應(yīng)的最早期防衛(wèi)反應(yīng)之一[17-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)接種處理后的花生葉片O2-含量在接種后5～9 d明顯增加，這與花生葉片在侵染初期產(chǎn)生大量的活性氧進(jìn)行防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)，高抗品種魯花11號(hào)最早（5 d）對(duì)花生褐斑病的侵染進(jìn)行了應(yīng)答響應(yīng)，抗病品種花育20號(hào)次之（7 d），而高感品種粵油7號(hào)相對(duì)滯后（9 d）。同時(shí)，活性氧的大量積累使得膜脂過(guò)脂化作用增強(qiáng)，因而使得MDA含量隨之增加，高感品種粵油7號(hào)在接種9 d后MDA含量大幅上升，抗病品種花育20號(hào)次之，而高抗品種魯花11號(hào)含量變化不大。由此說(shuō)明，受褐斑病菌的侵染不同抗性的花生葉片均對(duì)此進(jìn)行了早期的應(yīng)答響應(yīng)，導(dǎo)致不同時(shí)期內(nèi)花生葉片中活性氧含量的上升以及過(guò)脂化作用的增強(qiáng)，且抗性越強(qiáng)的花生品種響應(yīng)時(shí)間越迅速，葉片細(xì)胞遭受破壞越小，細(xì)胞功能喪失越少。

植物在被病原物侵染后，由于O2-的積累和過(guò)脂化物的增加，體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致活性氧代謝失調(diào)，會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，如細(xì)胞膜透性改變、電解質(zhì)滲漏、關(guān)鍵酶活性改變等，直接導(dǎo)致細(xì)胞功能的缺失，SOD、CAT和POD是植物體內(nèi)重要的活性氧清除酶，因而其含量與植物抗性密切相關(guān)[20，21]。PPO能將酚類物質(zhì)氧化成對(duì)病原有毒的醌類物質(zhì)，與植物抗病性密切相關(guān)，PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，為木質(zhì)素和植保素的合成提供前體，因而此類酶常被看成植物抗病性的生化指標(biāo)[22，23]。黃玉茜等[24]分析了花生在連作條件下防御酶系活性以及膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物含量的變化規(guī)律，證明逆境脅迫可以改變花生葉片防御酶活性和MDA含量。宋培玲等[25]研究發(fā)現(xiàn)黑脛病侵染直接影響油菜體內(nèi)5種防御酶含量及活性變化規(guī)律。馬瑩瑩等[26]對(duì)玉米抵御玉蜀黍尾孢菌侵入葉片內(nèi)防御酶系的變化和生理機(jī)制進(jìn)行研究，表明玉米植株受玉蜀黍尾孢菌侵染后防御酶活性及其相應(yīng)基因表達(dá)變化與其品種抗性直接相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，受花生褐斑病菌脅迫后，不同花生品種葉片中CAT、SOD及POD含量的變化均呈現(xiàn)出先小幅上升后下降再上升的趨勢(shì)，且抗性品種中CAT、SOD及POD的含量相對(duì)較高，在接種后5 d魯花11號(hào)葉片中的CAT含量即達(dá)到最大值，而粵油7號(hào)出現(xiàn)高峰的時(shí)間相對(duì)滯后，同時(shí)，接種后的魯花11號(hào)葉片內(nèi)的SOD和POD含量均高于粵油7號(hào)。在接種花生褐斑病菌后，3種花生葉片中PAL含量相對(duì)穩(wěn)定，魯花11號(hào)葉片中PAL的含量均明顯高于粵油7號(hào)，花育20號(hào)葉片中PAL的含量介于魯花20號(hào)和粵油7號(hào)葉片中PAL含量的中間值。同時(shí)，在接種花生褐斑病菌后，魯花11號(hào)和花育20號(hào)葉片內(nèi)PPO的含量在接種后有明顯上升，并于7 d達(dá)到最大峰值，此后持續(xù)下降，且花育20號(hào)葉片中PPO的含量明顯低于魯花11號(hào)?；ㄉ~片中防御酶含量的提升導(dǎo)致活性氧清除能力的提高，O2-和MDA含量的下降，使細(xì)胞遭受的結(jié)構(gòu)性破壞減小，細(xì)胞功能性的喪失越少。細(xì)胞功能性的完整與否直接影響花生葉片內(nèi)相關(guān)防御酶的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，抗性越強(qiáng)的花生品種接種后防御酶含量越高，對(duì)活性氧的消除能力越強(qiáng)，越能更好地保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，維持植物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。

周瑜等[27]對(duì)糜子葉片防御酶系及抗氧化物質(zhì)對(duì)黑穗病菌脅迫的響應(yīng)進(jìn)行研究，其結(jié)果表明黑穗病菌脅迫可引起糜子葉片防御酶活性及抗氧化物質(zhì)含量變化，含量在抗病品種和感病品種間存在顯著差異，可作為鑒定糜子對(duì)黑穗病抗性的生理生化指標(biāo)。袁廣勝等[28]對(duì)串珠鐮刀菌引起玉米穗粒腐病防御酶變化進(jìn)行了測(cè)定，表明PAL和POD活性水平與玉米抗性呈負(fù)相關(guān)；MDA與材料抗性呈正相關(guān)，玉米植株感病后防御酶活性變化的分析可為深入研究玉米穗粒腐病抗病機(jī)制和抗病育種提供理論依據(jù)。本研究對(duì)花生褐斑病菌脅迫下不同抗性花生葉片防御酶活性與病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析可見(jiàn)，病情指數(shù)與3個(gè)花生品種葉片中5種防御酶的含量均呈負(fù)相關(guān)，即防御酶的含量越高，病情指數(shù)越低，其中SOD及PAL含量在抗病品種和感病品種間存在顯著差異，可作為鑒定花生對(duì)褐斑病抗性的生理生化指標(biāo)，亦可對(duì)花生抗褐斑病機(jī)制以及抗病品種選育提供參考。

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