謝婉鳳, 梁光紅, 張飛萍

(1.福建農(nóng)林大學金山學院；2.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002)

病蟲害是限制林木正常生長發(fā)育的主要因素.馬尾松作為中國特有的速生豐產(chǎn)鄉(xiāng)土樹種，是中國南方荒山造林和工業(yè)生產(chǎn)的重要樹種[1]，松材線蟲病等病害卻嚴重影響著馬尾松的生產(chǎn)，是馬尾松的一種毀滅性病害[2].全國每年有超過500萬株松樹死于松材線蟲病，年均發(fā)生面積達7 000 hm2[3]，造成的直接和間接經(jīng)濟損失超過250億人民幣.因此，揭示松材線蟲對馬尾松的侵害機制對尋求持久有效的松材線蟲病控制措施具有重要意義.

松材線蟲病的發(fā)現(xiàn)己有百年歷史，但僅在近幾十年才對其進行系統(tǒng)研究，包括病原線蟲形態(tài)學、生物學和傳播媒介，寄主松樹感病性，松材線蟲病發(fā)生、擴散規(guī)律以及防控技術(shù)措施等[4].松材線蟲病的致病機理是目前的研究熱點，對此主要有三種觀點：第一種觀點認為松材線蟲分泌的酶破壞了松樹薄壁細胞的細胞壁以及細胞膜，進而導致了樹脂道中的樹脂異常滲漏并擴散進入鄰近管胞，水分的輸導也因此而受阻，致使馬尾松萎蔫；第二種觀點認為受松材線蟲侵染的松樹其木質(zhì)部產(chǎn)生了揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)，這些物質(zhì)進入管胞致使其形成空洞，阻礙水分輸導；第三種觀點則認為松樹在受到松材線蟲的侵染后，其體內(nèi)產(chǎn)生了毒性物質(zhì)導致松樹萎蔫[5].盡管上述觀點還存在爭議，但它們證實了松材線蟲的侵染會引起松樹全身性系統(tǒng)反應，最終導致松樹的枯萎死亡[6].

當前，松材線蟲對馬尾松的致病作用研究主要集中于生理、病理變化層面.有研究發(fā)現(xiàn)，接種松材線蟲的馬尾松中多酚氧化酶的活性提高，并在抗性種源中的提高程度大于敏感的種源；抗性種源中的總酚和綠原酸的含量也高于敏感的種源，并且這些次生物質(zhì)在抗性種源中能夠保持較長時間的高水平的含量，從而推測多酚氧化酶的活性以及酚類次生化合物的含量與馬尾松的抗病能力存在關(guān)系[7].在馬尾松感染松材線蟲后反射光譜方面的研究結(jié)果認為，中紅外波段反射光譜曲線能夠在一定程度上指示松樹的初期發(fā)?。浑S著病害的加深，馬尾松針葉中的葉綠素含量也不斷降低，并與光譜特征參數(shù)之間存在顯著的線性關(guān)系[8].張慧等[9]研究認為，松材線蟲的侵害影響了馬尾松的光合作用能力和抗氧化酶的活性，其中感病馬尾松的凈光合速率先短暫上升后不斷下降，并隨著病害指數(shù)的增加而呈現(xiàn)負值，通過分析葉綠素熒光的變化認為光合作用的下降是由光合系統(tǒng)Ⅱ的變化引起的，且受侵害的馬尾松針葉含水量變化導致葉綠素含量下降，并最終影響了針葉的光合作用能力，受侵害的馬尾松的抗氧化酶系統(tǒng)也受到明顯的影響.

植物抗性是其抵抗不利環(huán)境的重要基礎(chǔ)[10].逆境條件下，植物的抗氧化物含量、抗氧化酶活性均會產(chǎn)生變化，從而影響植物的抗逆能力[11].植物生理抗性的物質(zhì)包括兩類，一類是總酚、黃酮等植保素類次生化合物[12-13]，另外一類是抗氧化酶[14].這些次生化合物含量以及抗氧化酶活性的高低直接影響了植物的抗逆能力；此外，脯氨酸作為植物滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，在植物的抗逆調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用[15-16].在松材線蟲的侵害下，寄主馬尾松的抗性防御系統(tǒng)會受到影響[17]，相關(guān)基因的表達水平也同時發(fā)生改變，鑒于此，本研究通過測定分析松材線蟲侵染后馬尾松的脯氨酸含量及抗氧化酶活性的變化，同時檢測相關(guān)基因的表達情況，結(jié)合生理酶活性及對應基因的表達變化探討松材線蟲侵染對馬尾松逆境防御能力的影響，以期進一步揭示松材線蟲的致病機理.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬尾松(Pinusmassoniana)為種植于福建農(nóng)林大學森林保護研究所溫室中的2年生幼苗.供試松材線蟲分離自福建省漳州市薌城區(qū)的馬尾松疫木，并于擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)菌落[17]上純培養(yǎng).

1.2 試驗方法

1.2.1 松材線蟲懸浮液制備及接種馬尾松 參照徐華潮等[17]和Xie et al[18]的方法制備松材線蟲的懸浮液并采用皮接法接種馬尾松.用無菌的刀片在距離馬尾松基部10 cm的主莖的一側(cè)斜切出約1 cm的傷口，傷口深至木質(zhì)部，繼而在傷口內(nèi)固定一個經(jīng)滅菌處理的脫脂棉球，并用封口膜將棉球固定形成斜漏斗狀，往棉球中接種100 μL分別含有1 000、2 000、2 500、5 000、10 000、20 000條松材線蟲的懸濁液，作為處理組，并以接種100 μL無菌水的馬尾松作為對照組，接種后保濕24 h.處理組與對照組均放置于30 ℃溫室中培養(yǎng).

1.2.2 取樣 接種后的1、2、3 d，分別取處理組(接種2 000條松材線蟲)和對照組的馬尾松松針，液氮速凍，用于總RNA的提取和檢測編碼富含脯氨酸的阿拉伯半乳聚糖蛋白(proline-rich arabinogalactan protein 4, AGP4)的基因表達.在接種后3、5、7、9、11和14 d，分別取處理組(接種2 000條松材線蟲)和對照組的馬尾松的針葉樣本各1 g，用于提取粗酶液.此外，在松材線蟲侵染2 d后，分別取接種不同蟲量(1 000、2 500、5 000、10 000、20 000條)的處理組及其對照組的針葉、莖干及枝條0.5 g，用于提取總RNA，檢測POD基因的表達.各處理組及其對照組均取3個重復.

1.2.3 松材線蟲侵染的馬尾松針葉抗氧化酶活性及脯氨酸含量測定 采用北京索萊寶科技有限公司的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、銅-鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)試劑盒、過氧化物酶(perxiodase, POD)試劑盒分別測定處理組與對照組中的SOD、Cu-Zn SOD及POD的活力；采用脯氨酸試劑盒測定處理和對照樣本中的脯氨酸含量.

1.2.4 總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及目標基因的熒光定量PCR檢測 采用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit (Omega) RNA提取試劑盒，參照操作手冊分別提取各處理組及對照組的針葉、莖干、枝條的總RNA.采用TIANScript RT Kit(北京天根)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成為單鏈cDNA.

檢測AGP4基因(F:5′-GGGGTGCTACACTTATTTCC-3′, R:5′-GCTAACTGCTTTATCGGCTC-3′)和POD基因(F:5′-CACGGTTCGGTTGTAGTTC-3′, R:5′-CACAGTGGTGGGCATTTC-3′)的表達情況，以肌動蛋白(Actin)基因作為內(nèi)參基因(F:5′-CCTTGGCAATCCACATC-3′, R:5′-TCACCACTACGGCAGAAC-3′).

qPCR試劑采用北京全式金的TransStartGreen qPCRSuperMix Kit, PCR反應在美國ABI公司的QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System上完成，94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,50～60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s (41cycles )讀取熒光;95 ℃ 10 min,60～95 ℃ 0.02 ℃·s-1,20 min,讀取熒光.松材線蟲接種不同天數(shù)后的馬尾松較其對照處理的基因相對表達變化量采用2-ΔΔct法進行計算[19]，對照馬尾松樣本的基因表達量均歸一化(normalize)為1.

1.3 數(shù)據(jù)處理

處理組與對照組之間采用單因素方差分析進行顯著性差異比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲侵染后馬尾松針葉中的脯氨酸含量變化

由圖1可見，松材線蟲侵染后，處理組中的脯氨酸的含量呈先降低后升高再降低的變化趨勢，且在侵染11 d后的處理組中的含量顯著低于對照樣本，推測隨著侵染時間的延長，受侵染馬尾松的滲透調(diào)節(jié)能力可能受到了影響.此外，qPCR檢測編碼AGP4基因在松材線蟲接種1、2、3 d的馬尾松中的表達水平，顯示該基因在接種1 d后的馬尾松中表達較對照組下調(diào)，3 d后的表達下調(diào)程度加大，表明松材線蟲侵染下馬尾松針葉中該基因的表達變化與脯氨酸含量的變化存在一定的相關(guān)性.

“**”表示處理組與對照組存在極顯著性差異(P<0.01).圖1 松材線蟲侵染后馬尾松針葉中脯氨酸含量及AGP4基因表達變化Fig.1 Dynamic change of proline contents and AGP4 gene expression level in the needles of P.massoniana after B.xylophilus infestation

2.2 松材線蟲侵染后馬尾松針葉POD和SOD基因的表達變化

松材線蟲的侵染還影響馬尾松的POD和SOD基因的表達水平.通過分析前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，馬尾松中的2個編碼POD基因(Unigene0020188, Unigene0034965)、2個編碼SOD基因(Unigene0020266、Unigene0024712)以及一個編碼Cu-ZnSOD基因(Unigene0031949)在接種松材線蟲1、2、3 d的馬尾松針葉中的表達量均低于對照組；此外，另外一個編碼POD基因(Unigene0018599)和另外一個編碼Cu-ZnSOD基因(Unigene0027785)在接種松材線蟲1 d的樣本中較對照下調(diào)表達，隨后在接種松材線蟲2 d的樣本中表達量提高，但其在接種松材線蟲3 d的樣本中的表達量又降低(圖2).可見松材線蟲侵染下馬尾松針葉中的過氧化物酶活性降低與編碼該酶的多個基因的下調(diào)表達有關(guān).

2.3 松材線蟲侵染后馬尾松針葉SOD和POD酶活力的變化

通過測定松材線蟲侵染不同天數(shù)馬尾松針葉中SOD和POD酶活力，結(jié)果顯示，隨著侵染天數(shù)的增加，受侵染的馬尾松針葉中的SOD和POD的活力呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢.其中，與未經(jīng)松材線蟲侵染的馬尾松樣本中的SOD和POD酶活性相比，侵染3，7，11，14 d的馬尾松針葉中的POD活性均顯著低于其對照組；侵染3，5，9，11，14 d的馬尾松針葉中的SOD活性也都顯著低于其對照組.此外，侵染11，14 d的馬尾松針葉中的Cu-Zn SOD活性也顯著低于其對照組(圖3).由此可見，對于2年生的馬尾松苗，松材線蟲侵染10天后，松苗的抗氧化酶活性顯著降低，抗病防御能力下降.

CK:對照組；TR1:接種1 d；TR2：接種2 d；TR3：接種3 d.圖2 松材線蟲侵染后馬尾松針葉中POD, SOD和Cu-Zn SOD基因的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic gene expression change of the POD, SOD, and Cu-Zn SOD from the P.massoniana after B.xylophilus infestation

“**”表示處理組與對照組存在極顯著性差異(P<0.01).圖3 松材線蟲侵染下不同天數(shù)下的馬尾松中SOD和POD酶活性的變化Fig.3 Changes of SOD and POD activities in P.massoniana after different days of B.xylophilus infestation

2.4 松材線蟲不同蟲量接種后馬尾松POD基因的表達變化

分別接種1 000、2 500、5 000、10 000、20 000條松材線蟲于2年生馬尾松，2天后，檢測POD基因在馬尾松莖、枝和葉中的表達變化.結(jié)果顯示，接種松材線蟲1 000的馬尾松莖、枝、針葉中的POD基因表達較對照組的莖、枝、針葉中該基因上調(diào)表達；隨著接種蟲量的增加，馬尾松莖、枝條中的POD基因表達水平降低，并在接種20 000條松材線蟲的馬尾松中的表達量最低；與之相對，該基因在針葉中的基因表達水平持續(xù)提高，并在接種20 000條松材線蟲的馬尾松針葉中的表達量最高 (圖4).由此可見，該基因在馬尾松不同組織中的表達具有空間差異性.

3 討論

病原菌是引起植物侵染性病害的主要因子，這種侵害作用往往造成受害植物的生理代謝功能紊亂、生長發(fā)育受阻甚至植株枯萎死亡.植株組織中的抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性能夠影響植物的抗逆能力，而植物在不同的發(fā)育階段其抗逆能力也不同.馬尾松是多年生樹種，不同生長年限下的馬尾松的抗病能力存在差異，其中以苗期的抗病能力較強，而成熟樹齡的抗病能力較弱，但不同種源之間也存在差異[20-21].本研究以2年生的馬尾松苗為材料接種松材線蟲，研究該樹齡的馬尾松的抗病能力，研究結(jié)果顯示松材線蟲侵染后的馬尾松針葉的脯氨酸含量顯著降低，脯氨酸是植物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[22]，其在植株中含量降低將不利于馬尾松的滲透調(diào)節(jié)，影響植株的抗逆能力；與之相應，AGP4基因的表達也受到抑制，該蛋白在植物的生長與發(fā)育過程中具有重要作用[23]，可見松材線蟲侵染導致馬尾松的水分運輸受阻，其滲透調(diào)節(jié)作用也被抑制，不利于植株的生長.松材線蟲侵染導致馬尾松莖干的水分輸導受阻，致使植株逐漸枯萎死亡，在此過程中，植株的滲透調(diào)節(jié)能力也受到影響.

圖4 不同數(shù)量松材線蟲侵染下的馬尾松莖、枝、針葉中的POD基因的表達變化Fig.4 Gene expression changes of POD in the stem, branch, and needle leaf of P.massoniana with different quantities of B.xylophilus infestation

此外，松材線蟲侵染還抑制了馬尾松中保護酶的活性.其中，SOD能夠催化超氧化物的歧化反應，具有清除活性氧自由基的作用，活性氧自由基是逆境脅迫下生物植物細胞中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，對細胞產(chǎn)生氧化傷害[24].Cu-Zn SOD作為總SOD的一種，含Cu、Zn金屬輔基，是最為常見的一種酶，主要存在于機體細胞漿中.受侵染的馬尾松中SOD以及Cu-Zn SOD的活性降低將不利于細胞抗氧化作用.此外，POD在木質(zhì)素的合成的催化過程，植物木質(zhì)素合成增強有利于受侵染組織的木質(zhì)化形成物理屏障，抵御病菌侵害，因此，植物POD的活性高低對其抗病能力強弱呈正相關(guān)性[25-26].在本研究中，松材線蟲侵染致使馬尾松的POD活性降低，并顯著低于對照組，不利于馬尾松合成木質(zhì)素抵御病菌的侵害.隨著侵染蟲量的加大，POD基因在受侵染初期的馬尾松的莖干和枝條的表達水平就不斷下降，可見該酶的基因表達也受到抑制，同時還發(fā)現(xiàn)該基因在針葉中的表達水平上升，可見侵染初期不同組織中的基因表達模式不同，這可能與侵染初期松材線蟲僅存在莖干，還未在整株中擴散有關(guān)；而對于受侵染的莖干部分，隨著侵染蟲量的不斷加大，該基因的表達不斷下調(diào)，體現(xiàn)了POD基因表達與植物抗病性的相關(guān)性.

綜上，本研究認為松材線蟲侵染致使2年生馬尾松苗中與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的脯氨酸含量、與抗氧化能力相關(guān)的SOD以及木質(zhì)素合成相關(guān)的POD的活性下降，相關(guān)基因的表達也受到影響，從而破壞了馬尾松植株的整體抗性，導致馬尾松最終的枯萎死亡.