龐建虎, 喬龍亮, 朱 鵬，, 高威芳, 章禮萍

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211;2.寧波海洋研究院,浙江 寧波 315832 )

近年來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益都是空前的.目前，我國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)量占動(dòng)物性食物的1/3，處在世界首位，人均占有量高于世界平均水平[1].但隨著集約化養(yǎng)殖方式的大規(guī)模應(yīng)用，產(chǎn)量提高的同時(shí)也導(dǎo)致了病害的頻繁爆發(fā).同時(shí)，由于我國(guó)水產(chǎn)疫苗研究起步較晚，只有較少種類的疫苗可供使用[2].鑒于此，我國(guó)水產(chǎn)病害的防治主要以預(yù)防為主，快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法對(duì)于及時(shí)找出病原體顯得尤為重要.因?yàn)橹挥姓页稣嬲牟≡拍軐?duì)癥下藥，在疾病發(fā)生時(shí)盡量將損失減小到最低.然而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(選擇性培養(yǎng)基和生理生化試驗(yàn)檢測(cè))，盡管也能檢測(cè)出病原體，但費(fèi)力、費(fèi)時(shí)和低靈敏度等缺點(diǎn)使得其不適合于當(dāng)前水產(chǎn)病原體的疫情防控.如致病性嗜水氣單胞菌的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法是經(jīng)過(guò)一系列的生理生化試驗(yàn)鑒定，其檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作十分復(fù)雜[3].

分子生物學(xué)檢測(cè)方法在靈敏度、特異性和檢測(cè)時(shí)間等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)病原體檢測(cè)方法.核酸擴(kuò)增在分子生物學(xué)檢測(cè)中是常用的手段，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是目前使用最頻繁的核酸擴(kuò)增技術(shù).然而對(duì)精密溫控儀器的依賴限制了其在條件較差的實(shí)驗(yàn)室及基層漁場(chǎng)的使用，尤其不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè).而核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要精密的溫控循環(huán)設(shè)備,在一個(gè)特定的溫度下通過(guò)添加不同性質(zhì)的酶和特異性引物即可快速完成核酸的擴(kuò)增，極大地降低了對(duì)設(shè)備的要求，縮短了反應(yīng)時(shí)間，近年來(lái)正蓬勃發(fā)展.

筆者通過(guò)對(duì)近十年來(lái)相關(guān)文獻(xiàn)的整理發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是從核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的開(kāi)發(fā)上，還是其在病原體的檢測(cè)應(yīng)用上，大多數(shù)都是由國(guó)外研究者開(kāi)展的，而國(guó)內(nèi)研究者在這方面涉足較少.本文對(duì)目前常見(jiàn)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)等方面做了比較，并對(duì)它們?cè)谒a(chǎn)病原體的檢測(cè)應(yīng)用上做了系統(tǒng)的綜述，希望能夠幫助國(guó)內(nèi)讀者快速了解核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，促進(jìn)該技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用.

1 常見(jiàn)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及比較

目前常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增(helicase-dependent isothermal amplification, HDA)、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增(strand displacement amplification, SDA)、交叉引物等溫?cái)U(kuò)增(crossing priming amplification, CPA)、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)和重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)等[4].

1.1 LAMP

LAMP技術(shù)于2000年由日本Eiken公司發(fā)明[5].其原理是：根據(jù)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條不同的引物(內(nèi)引物和外引物)，通過(guò)在反應(yīng)體系中添加具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶、反應(yīng)模板和基質(zhì)等，在一定溫度(60～65 ℃)下不斷地進(jìn)行DNA合成，從而達(dá)到目的基因快速擴(kuò)增的目的，可在15～60 min實(shí)現(xiàn)109～1 010倍的擴(kuò)增.

LAMP技術(shù)具有對(duì)設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).因其有著高度的特異性，因此只需根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無(wú)即可對(duì)靶基因序列的存在與否作出判斷.LAMP的缺點(diǎn)也是比較明顯，如需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，使得引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜；其次是在對(duì)常規(guī)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)時(shí)，需要打開(kāi)蓋子，容易形成氣溶膠，造成假陽(yáng)性[6].

1.2 HDA

HDA是美國(guó)的研究者在2004年發(fā)明的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增原理類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制.主要原理如下：首先，通過(guò)解旋酶在恒等溫的條件下使得DNA雙鏈打開(kāi)，隨即單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合到DNA單鏈上，抑制單鏈DNA重新形成雙鏈DNA，在體系中提供了能夠與引物互補(bǔ)結(jié)合的單鏈DNA模板，在DNA聚合酶催化下進(jìn)行延伸(圖1).剛剛合成的雙鏈DNA隨即又進(jìn)入新的循環(huán)，結(jié)果使得目的基因呈指數(shù)式增長(zhǎng)[7].

圖片來(lái)源于文獻(xiàn)[6].A：解旋酶解開(kāi)DNA雙鏈；B：引物與單鏈DNA結(jié)合；C：DNA 聚合酶在引物基礎(chǔ)上延伸，兩條子鏈擴(kuò)增形成；D：新的循環(huán)開(kāi)始.圖1 HDA反應(yīng)原理Fig.1 The principle of HDA reaction

相較于傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增，HDA在于加入了解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白，且整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程是在一個(gè)溫度條件下進(jìn)行的，避免了PCR擴(kuò)增過(guò)程中通過(guò)溫控儀來(lái)控制反應(yīng)的進(jìn)行.目前，研究者通過(guò)在體系中添加逆轉(zhuǎn)錄酶等，HDA也已經(jīng)成功應(yīng)用于RNA模板的擴(kuò)增[8].HDA技術(shù)原理和對(duì)設(shè)備要求均簡(jiǎn)單，只需要恒溫器即可，無(wú)需復(fù)雜引物.

1.3 NASBA

NASBA技術(shù)是在PCR擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸擴(kuò)增技術(shù).NASBA是在等溫條件下通過(guò)3種酶來(lái)控制反應(yīng)，分別是來(lái)自禽流感病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、來(lái)自大腸桿菌的核糖核酸酶(RNaseH)和來(lái)自噬菌體的T7RNA聚合酶[9].其原理是：整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程包括非循環(huán)相和循環(huán)相.在非循環(huán)相擴(kuò)增過(guò)程中，反向引物在模板RNA上掃描與之互補(bǔ)的序列，隨之反向引物與其特異性結(jié)合，在AMV的催化作用下合成互補(bǔ)的cDNA鏈，形成了RNA-DNA雜合體.隨即RNAaseH特異地將RNA-DNA雜合體中的RNA鏈降解掉，帶有啟動(dòng)子序列的正向引物與單鏈cDNA結(jié)合，合成雙鏈DNA.由于新合成的雙鏈DNA帶有可以被T7RNA聚合酶特異地識(shí)別的啟動(dòng)子序列，由此進(jìn)入循環(huán)相擴(kuò)增，高效、特異地合成反義RNA(圖2).

由于雙鏈DNA中T7啟動(dòng)子序列的加入，而外來(lái)DNA不具有這樣的結(jié)構(gòu)，因此，NASBA不易受到污染，使得其特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通PCR擴(kuò)增技術(shù)[10].

圖片來(lái)源于文獻(xiàn)[11].A：反向引物在RNA模板掃描與之互補(bǔ)的序列；B：反向引物與模板特異性結(jié)合；C：RNA-DNA雜合體形成；D：RNA-DNA雜合體中的RNA鏈被降解；E：帶有啟動(dòng)子序列的正向引物與單鏈DNA結(jié)合；F：互補(bǔ)鏈DNA延伸，帶有T7啟動(dòng)子序列的DNA雙鏈形成，以此為模板合成正向RNA；M、L、G、K、H、J、I：循環(huán)相步驟.圖2 NASBA反應(yīng)原理Fig.2 The principle of NASBA reaction

1.4 SDA

Walker et al[12]于1992年開(kāi)發(fā)了SDA.其主要原理是：首先，通過(guò)引物與單鏈DNA進(jìn)行特異地識(shí)別，在具有鏈置換活性的聚合酶催化下合成具有HincⅡ酶識(shí)別位點(diǎn)的目的DNA序列，由此進(jìn)行SDA循環(huán)擴(kuò)增.通過(guò)HincⅡ酶切割具有識(shí)別位點(diǎn)的目的DNA序列，通過(guò)聚合酶在切割處對(duì)3′端進(jìn)行延伸擴(kuò)增，互補(bǔ)鏈則被替換；新合成的替代鏈作為新的模板，體系中通過(guò)循環(huán)進(jìn)行這些步驟，達(dá)到目的DNA序列快速擴(kuò)增的目的.

SDA雖然具有擴(kuò)增效率高和特異強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，如反應(yīng)成本較高，且由于產(chǎn)物中存在單、雙鏈DNA產(chǎn)物，因此電泳時(shí)拖尾現(xiàn)象較明顯.

1.5 CPA

CPA由杭州優(yōu)思達(dá)公司完全獨(dú)立研發(fā)，是目前我國(guó)首個(gè)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[13].該技術(shù)無(wú)需預(yù)變性步驟或者通過(guò)切口酶打開(kāi)雙鏈，在恒溫63 ℃下引物與模板結(jié)合成混合物，反應(yīng)產(chǎn)物中通過(guò)自發(fā)形成的泡狀結(jié)構(gòu)，交叉引物與5′端的結(jié)合可激發(fā)鏈置換反應(yīng)的進(jìn)行[14].CPA技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn).但該反應(yīng)體系復(fù)雜、方法不穩(wěn)定和假陽(yáng)性現(xiàn)象等缺點(diǎn)也限制了該技術(shù)的使用[4].

1.6 RCA

RCA技術(shù)于1998年建立的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增原理類似于CPA技術(shù)[15].目前主流的指數(shù)RCA的主要原理是：首先，正向引物結(jié)合到環(huán)狀DNA序列上，在聚合酶作用下繼續(xù)延伸，產(chǎn)生帶有反向引物的結(jié)合位點(diǎn)的單鏈DNA，隨即反向引物結(jié)合到單鏈DNA并進(jìn)行延伸，產(chǎn)生的子代單鏈DNA充當(dāng)模板，進(jìn)行新的擴(kuò)增(圖3).擴(kuò)增的結(jié)果是產(chǎn)生許多長(zhǎng)短不一的雙鏈DNA產(chǎn)物，擴(kuò)增效率大大提高.雖然RCA技術(shù)具有高靈敏度和高效的擴(kuò)增技術(shù)，但也存在著鎖式探針連接效率、背景信號(hào)干擾和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)制約等問(wèn)題[16].

圖片來(lái)源于文獻(xiàn)[6].A：正向引物結(jié)合到環(huán)狀DNA序列上并進(jìn)行延伸；B：繼續(xù)擴(kuò)增，產(chǎn)生帶有反向引物的結(jié)合位點(diǎn)的單鏈DNA;C：反向引物結(jié)合到單鏈DNA并進(jìn)行延伸；D：產(chǎn)生的子代單鏈DNA充當(dāng)模板，進(jìn)行新的擴(kuò)增.圖3 指數(shù)RCA擴(kuò)增原理Fig.3 The principle of hyperbranched RCA reaction

1.7 RPA

RPA技術(shù)是被稱為有望替代PCR技術(shù)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，是由英國(guó)TwistDx公司開(kāi)發(fā)的核酸等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)品.該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，一個(gè)簡(jiǎn)單水浴鍋即可[17].它的原理是：在恒溫(37～42 ℃)條件下，重組酶與引物結(jié)合形成聚合物，能夠在模板鏈無(wú)需熱變性的情況下與引物同源序列結(jié)合，通過(guò)鏈置換反應(yīng)形成一個(gè)“D”字型環(huán)；在聚合酶催化下進(jìn)行延伸，子鏈分離并繼續(xù)延伸，對(duì)DNA序列進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增(圖4).

RPA技術(shù)的關(guān)鍵和難點(diǎn)在于前期引物和探針的設(shè)計(jì)，大多數(shù)PCR引物都不適合，且目前沒(méi)有專門的引物設(shè)計(jì)軟件，需要研究者親自摸索.其擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟類似于普通PCR產(chǎn)物的檢測(cè)；也可以通過(guò)將RPA技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條(lateral flow dipstick, LFD)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，通過(guò)試紙條檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物；還可以在反應(yīng)體系中加入探針，構(gòu)建實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)情況的實(shí)時(shí)熒光RPA.

盡管核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)一般只需要在恒定溫度下就可以完成擴(kuò)增，但各種核酸等溫?cái)U(kuò)增所需要的溫度不同，以及它們擴(kuò)增需要的引物數(shù)量、酶的種類和擴(kuò)增時(shí)間等方面各不相同，筆者通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的閱讀并結(jié)合本課題組的科研經(jīng)歷，在表1系統(tǒng)地列舉了各種常見(jiàn)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)所需引物數(shù)量、溫度、時(shí)間及優(yōu)缺點(diǎn).

圖片來(lái)源于文獻(xiàn)[18].A：重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物，并與同源靶序列結(jié)合；B：通過(guò)鏈置換形成一個(gè)“D”字型環(huán)；C：聚合酶促使引物延伸；D：子鏈分離，并繼續(xù)延伸；E：子鏈形成.圖4 RPA反應(yīng)原理Fig.4 The principle of RPA reaction

技術(shù)引物/條溫度/℃時(shí)間/min優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)LAMP460～6560特異性強(qiáng),擴(kuò)增效率高引物設(shè)計(jì)復(fù)雜HDA260～65120擴(kuò)增效率高,引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單 需要復(fù)雜的反應(yīng)體系優(yōu)化過(guò)程N(yùn)ASBA237～4290～120檢測(cè)速度快,有商業(yè)試劑盒可以使用不適用于DNA的擴(kuò)增SDA437120效率高主要適用于短片段的擴(kuò)增CPA46370操作簡(jiǎn)便反應(yīng)體系復(fù)雜 RCA13760適合于單鏈DNA的擴(kuò)增成本高RPA225～4220引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,特異性高對(duì)反應(yīng)條件要求高

2 在水產(chǎn)病原體快速檢測(cè)上的應(yīng)用現(xiàn)狀

通過(guò)對(duì)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中近十年來(lái)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在水產(chǎn)病原體檢測(cè)上應(yīng)用文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)：各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在水產(chǎn)病原體檢測(cè)上的應(yīng)用頻次差別較大；各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)限和檢測(cè)時(shí)間也各不相同；在細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等病原體的檢測(cè)上均有應(yīng)用.表2列舉了各種常見(jiàn)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)近十年來(lái)的具體應(yīng)用情況.

2.1 在細(xì)菌快速檢測(cè)上的應(yīng)用

LAMP技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性水產(chǎn)病原體的檢測(cè)上，在多種致病性弧菌和鏈球菌等的檢測(cè)上都已成功應(yīng)用(表2).王耀煥等[19]建立了創(chuàng)傷弧菌的LAMP快速檢測(cè)方法，能在1 h內(nèi)高效特異地檢出創(chuàng)傷弧菌，通過(guò)將LAMP技術(shù)與LFD技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立了創(chuàng)傷弧菌的LFD-LAMP檢測(cè)方法，能夠快速、靈敏、特異地檢測(cè)出創(chuàng)傷弧菌；Wang et al[20]建立了同時(shí)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的LAMP檢測(cè)方法，其靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，且可以在多種樣品中同時(shí)檢測(cè)出創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌；Suebsing et al[21]根據(jù)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的sodA基因設(shè)計(jì)引物，建立了羅非魚(yú)鏈球菌病的LAMP檢測(cè)方法，其靈敏度是巢穴PCR的10倍，結(jié)果可以直接通過(guò)觀察顏色變化讀取.

表2 近十年等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 The application of isothermal amplification in the rapid detection of aquatic pathogens in the past decade

HDA技術(shù)目前僅在霍亂弧菌、副溶血性弧菌和鰻弧菌等水產(chǎn)病原體的檢測(cè)上有應(yīng)用.Tong et al[73]將HDA技術(shù)與TaqMan探針結(jié)合起來(lái)，建立了高效、快速的檢測(cè)霍亂弧菌的方法.石琰璟等[61]根據(jù)副溶血性弧菌的tlh基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建了等溫條件下快速、特異地檢測(cè)副溶血性弧菌的HDA檢測(cè)方法，且特異性良好，檢測(cè)限達(dá)到19.9 ng，其靈敏度與普通PCR相當(dāng).梁君妮等[60]根據(jù)鰻弧菌的toxR基因設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化，成功構(gòu)建了基于HDA的鰻弧菌快速檢測(cè)方法.該方法能夠特異地檢出魚(yú)類鰻弧菌，不會(huì)與其他魚(yú)類病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)；其檢測(cè)限達(dá)到30 ng，使用構(gòu)建的方法對(duì)人工污染樣品的檢測(cè)限為2.1×102CFU，通過(guò)HDA對(duì)120份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)比PCR檢測(cè)技術(shù)的符合率為100%，陽(yáng)性檢出率優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法.

秦勝利等[62]根據(jù)溶藻弧菌的hsp60基因?yàn)槟康男蛄性O(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了溶藻弧菌的NASBA快速檢測(cè)體系.結(jié)果表明：該方法能特異地檢測(cè)出6.9×102CFU溶藻弧菌DNA，靈敏度比普通PCR方法高.倪鑫等[63]根據(jù)副溶血性弧菌的tlh基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物和探針，建立的NASBA檢測(cè)方法對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)限為5.1×102CFU，且與其他病原菌不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng).相比Wang et al[20]建立的LAMP檢測(cè)副溶血性弧菌方法和石琰璟等[61]建立的HDA 檢測(cè)副溶血性弧菌方法，LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)限和檢測(cè)時(shí)間明顯優(yōu)于其他兩種方法.

2.2 在病毒快速檢測(cè)上的應(yīng)用

LAMP技術(shù)在水產(chǎn)病毒病原體的檢測(cè)上應(yīng)用廣泛，尤其在蝦類病毒的檢測(cè)上.如李紅梅等[74]研究構(gòu)建了對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的LAMP檢測(cè)方法.結(jié)果表明：建立的LAMP檢測(cè)方法在63 ℃條件下，能夠在30 min內(nèi)檢測(cè)出106倍稀釋的IHHNV基因組DNA，與27種水生動(dòng)物及對(duì)蝦常見(jiàn)病原的DNA均無(wú)交叉反應(yīng).

CPA技術(shù)在水產(chǎn)病原體的檢測(cè)上已有報(bào)道.趙小金等[65]依據(jù)牡蠣皰疹病毒魁蚶株(OsHV-1-SB)全基因組序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了CPA檢測(cè)體系，并對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明：該方法能夠特異地檢測(cè)出30拷貝的質(zhì)粒DNA,使用建立的方法在對(duì)22份實(shí)際樣品的檢測(cè)中顯示，該方法簡(jiǎn)單、迅速、特異性強(qiáng).粟子丹[66]建立的赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒的CPA聯(lián)合切向流試紙條檢測(cè)方法(CPA-LFD)簡(jiǎn)單、快速，該方法能夠特異地檢測(cè)出10拷貝 RNA模板,比RT-PCR的檢測(cè)限還要高出10倍，與常見(jiàn)的魚(yú)類病毒性病原體均不會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng).楊昊霖[67]根據(jù)對(duì)蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)引物構(gòu)建了CPA檢測(cè)方法，并將該方法與WSSV的其他核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法進(jìn)行了比較.結(jié)果顯示，構(gòu)建的CPA檢測(cè)方法對(duì)WSSV的檢測(cè)限為10拷貝，靈敏度高于普通PCR檢測(cè)方法，與qPCR和LAMP方法有著相同的靈敏度，與其他常見(jiàn)的蝦類病毒IHHNV、HPV和副溶血性弧菌均沒(méi)有交叉反應(yīng).

2.3 在寄生蟲(chóng)快速檢測(cè)上的應(yīng)用

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在寄生蟲(chóng)的檢測(cè)上亦有少量應(yīng)用.Cai et al[23]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)魚(yú)的肝臟吸蟲(chóng)——中華肝吸蟲(chóng)，根據(jù)組織蛋白酶B3基因序列設(shè)計(jì)引物，建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度是傳統(tǒng)PCR技術(shù)的100倍.余傳信等[75]和Kumagai et al[24]分別建立了日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺的LAMP檢測(cè)方法，能夠在65 min內(nèi)分別檢測(cè)出100 fg和1 pg血吸蟲(chóng)DNA.余傳信等[75]將建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)在30只感染性釘螺實(shí)際樣品的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，LAMP的陽(yáng)性檢出率為93.33%，敏感性高于傳統(tǒng)PCR的陽(yáng)性檢測(cè)率(83.33%).

3 存在問(wèn)題及展望

3.1 在水產(chǎn)病原體快速檢測(cè)上存在的問(wèn)題

通過(guò)對(duì)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)近十年來(lái)的相關(guān)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)：眾多核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在水產(chǎn)病原體快速檢測(cè)上應(yīng)用最多、最成熟的是LAMP技術(shù)(41篇)，在細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的檢測(cè)上都有應(yīng)用，而其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在水產(chǎn)病原體的檢測(cè)上應(yīng)用較少或至今仍沒(méi)有應(yīng)用.而PCR這一經(jīng)典核酸擴(kuò)增技術(shù)盡管需要依賴于精密儀器且存在一些其他方面的不足，但毋庸置疑仍是目前體外核酸擴(kuò)增應(yīng)用最為成熟和廣泛的技術(shù).在國(guó)內(nèi)外有多種依據(jù)PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)試劑盒可供水產(chǎn)病原體的檢測(cè)使用，而對(duì)比核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，盡管也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但大多數(shù)還是處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，僅LAMP和NASBA檢測(cè)方法在致病菌檢測(cè)上有相關(guān)少量的試劑盒可供使用,并建立了相應(yīng)的進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 2754和GB/T 19439—2004)；但其他大多數(shù)重要的水產(chǎn)病原體卻未能建立核酸等溫檢測(cè)方法，可供使用的具有商業(yè)價(jià)值的水產(chǎn)病原體的試劑盒較少，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也不完善，這些都限制了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的使用和推廣.

3.2 展望

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，催生了各種核酸擴(kuò)增技術(shù)，但任何病原體檢測(cè)方法的研發(fā)，都要以實(shí)際應(yīng)用為最終目的.核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單、操作方便、在等溫條件下即可迅速完成反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視.然而，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)要想真正做到適應(yīng)于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，筆者認(rèn)為以下幾個(gè)方面將是未來(lái)研發(fā)的重點(diǎn).

3.2.1 開(kāi)發(fā)專門的引物設(shè)計(jì)軟件 目前，各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)除了LAMP技術(shù)具有專門適用的引物設(shè)計(jì)軟件外，其他技術(shù)均沒(méi)有專用的引物設(shè)計(jì)軟件供研究者使用，研究者往往是先根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)軟件預(yù)評(píng)估設(shè)計(jì)引物的優(yōu)劣，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選.根據(jù)本課題組的經(jīng)驗(yàn)得知，PCR技術(shù)軟件評(píng)出的結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往有很大的區(qū)別，這樣就大大增加了引物設(shè)計(jì)的工作量和成本.因此根據(jù)各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)出不同的引物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)于不同核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的推廣是至關(guān)重要的一步，它的完善必將推動(dòng)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的跨越式發(fā)展.

3.2.2 研發(fā)重要水產(chǎn)病原體的商業(yè)試劑盒 目前，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)雖然在水產(chǎn)病原體的檢測(cè)上有文獻(xiàn)報(bào)道(表2)，但大多數(shù)重要的水產(chǎn)病原體還未有專門的商業(yè)試劑盒可供非專業(yè)的基層養(yǎng)殖場(chǎng)從業(yè)人員使用.因此，基于各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出針對(duì)各種重要水產(chǎn)病原體的快速診斷試劑盒對(duì)于水產(chǎn)疾病的防控有重要的意義.

3.2.3 結(jié)合不同技術(shù) 各種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)盡管有諸多優(yōu)點(diǎn)，但還存在各自的缺點(diǎn)，研究者需要將不同技術(shù)結(jié)合起來(lái)使用[76-78]，克服技術(shù)本身的缺點(diǎn)，使得結(jié)果讀取更為方便和快捷.如將LFD技術(shù)與RPA技術(shù)結(jié)合起來(lái)，使得反應(yīng)結(jié)果通過(guò)試紙條顏色變化即可讀取，擺脫了對(duì)儀器的依賴，同時(shí)也不需要操作人有專業(yè)背景，特別適合我國(guó)基層養(yǎng)殖場(chǎng)使用.

本世紀(jì)以來(lái)，迅速發(fā)展的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)滿足了人類對(duì)蛋白質(zhì)的需求.快速、簡(jiǎn)便和靈敏的核酸等溫檢測(cè)技術(shù)非常適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層養(yǎng)殖場(chǎng)普及應(yīng)用.核酸等溫檢測(cè)技術(shù)的不斷完善、新的試劑盒出現(xiàn)以及與其他新技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，將極大地推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展.