劉雪薇, 厲 程, 韓海云, 張文鵬, 陳東英*

(1. 中國科學院上海藥物研究所, 上海 201203; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 上海藥品審評核查中心, 上海 201203)

基因毒性雜質是指在藥物中以痕量水平存在,能夠和DNA發(fā)生反應誘導DNA損傷,導致基因突變并有可能誘發(fā)癌癥的雜質[1,2]。與藥物中其他類型的雜質相比,基因毒性雜質具有在極低暴露水平下即能導致嚴重毒性的特點,因此對用藥的安全性造成嚴重的威脅?；撬狨ナ且活悵撛诘幕蚨拘噪s質,通常來源于藥物合成中磺酸或者其衍生物,如磺酰氯、磺酸酐和低級醇溶劑(如甲醇、乙醇、異丙醇等)之間發(fā)生的副反應。由于磺酸鹽藥物應用非常廣泛且其在合成中不可避免地會用到低級醇,使得磺酸酯在藥物中的殘留風險較為常見,因而備受人們關注。本文將首先對基因毒性雜質相關的監(jiān)管法規(guī)進行梳理,進一步對磺酸酯類基因毒性雜質的形成機理,控制策略以及相關的分析方法進行綜述。

1 基因毒性雜質監(jiān)管理念的演變

針對基因毒性雜質給用藥帶來的安全隱患,各國監(jiān)管機構的監(jiān)管理念主要經(jīng)歷了由追求完全避免、合理降低再到風險評估3個主要發(fā)展歷程[3,4]。

歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)[5]最先出臺了關于基因毒性雜質的控制法規(guī),其下屬的人用藥物委員會(原專利藥物委員會)于2002年發(fā)布了一份關于基因毒性雜質限度要求的咨詢意見書(Position paper on the limits of genotoxic impurities)。該意見書保守假設了基因毒性雜質在任何暴露水平均能造成DNA損傷,因此任何濃度水平的基因毒性雜質都會給用藥安全帶來風險?；诖思僭O,該意見書要求制藥企業(yè)盡可能尋求不會產(chǎn)生基因毒性雜質的“零風險”工藝路線;在達不到“零風險”要求的情況下,制藥企業(yè)需要提供足夠充分的理由,解釋無法避免基因毒性雜質的原因,并在技術水平能達到的情況下盡可能地減少(as low as technically feasible, ALATF)藥物中基因毒性雜質的殘留量。這份意見書給基因毒性雜質的控制提供了初步的實施方案和標準,但是它的保守性甚至是極端性也給制藥企業(yè)帶來了很大的挑戰(zhàn),在一定程度上阻礙了涉及相關藥物的研發(fā)進程。在該意見書的基礎上,EMA和制藥企業(yè)進行了多輪探討,于2006年頒布了《基因毒性雜質限度指南》(Guideline on the limits of genotoxic impurities)[6]。該指南不再追求難以實現(xiàn)的“零風險”,首次引入了毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern, TTC)的概念,并采用“最低合理可行”(as low as reasonably practical, ALARP)原則代替ALATF。TTC是指由引起50%腫瘤發(fā)生率(TD50值,由最敏感物種的最敏感腫瘤部位獲得),通過簡單線性外推至十萬分之一腫瘤發(fā)生率所對應的基因毒性雜質暴露量(不考慮DNA修復、細胞保護等因素帶來的影響)。通過線性外推,TTC值設定為1.5 μg/d,意味著當每人每天所攝入的基因毒性雜質的量小于1.5 μg時,人一生中(按壽命為70年計算)患癌癥的風險將小于十萬分之一。與之前尋求“零風險”的做法相比,TTC概念的引入對基因毒性雜質的控制來說有了長足進步,標志著對藥物中基因毒性雜質的控制進入了風險評估的發(fā)展階段。然而,無論長期用藥還是短期用藥,該指南都以1.5 μg/d 作為基因毒性雜質的控制限度,該限度水平對于終生服藥的患者來說是可以接受的,但是對于短期暴露的藥物來說顯然還是過于保守。2006年1月,由輝瑞、強生、葛蘭素史克等國際制藥企業(yè)中的研發(fā)人員組成的美國藥物研究和制造商協(xié)會(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, PhRMA)專家小組在Lutz Müeller等的領導下首次提出了“階段化TTC”的概念,即原料藥中的基因毒性雜質限度應當考慮藥物的暴露周期,暴露周期較短的藥物應當可以設定較高的控制限度[7]。“階段化TTC”概念是風險評估科學理念的進一步體現(xiàn),它的提出使得人們能夠根據(jù)用藥周期,科學、靈活地開展基因毒性雜質的控制。

基因毒性雜質通常含有某些特定的化學結構單元而具有高反應活性,在體內(nèi)轉化為高的生物活性,從而與DNA等功能分子發(fā)生反應而引起毒性。這些特定的化學結構單元具有基因毒性的警示性,被稱為警示結構[8,9]。常見的警示結構主要包括芳香胺、醛、N-亞硝基胺、氨基甲酸類、環(huán)氧丙烷、氮雜環(huán)丙烷、肼、鹵代烷烴和磺酸酯等類型(見圖1)。Müeller等[7]將藥物中的雜質按照結構特性及誘變性和致癌性分成了5類,并提出了相應的控制策略(見表1),為新藥研發(fā)及具體監(jiān)管的實施給出了更為合理的權衡方案。

圖 1 基因毒性雜質警示結構[7]Fig. 1 Alerting structures of genotoxic impurities[7] A: alkyl, aryl, or H; R: alkyl; EWG: electron withdrawing group (CN, C=O, ester, etc); PNAs: p-nitroaniline; PNAHs: polycyclic aromatic hydrocarbon.

表 1 按誘變性和潛在致癌性的雜質分類及相應的控制措施

EMA人用藥物委員會安全工作組就之前的《基因毒性雜質限度指南》發(fā)布了相關的問答[10],該問答接納了Müeller等的提議,采用“階段化TTC”的方法來確立臨床研發(fā)中具有不同用藥周期要求的藥物中基因毒性雜質的可接受攝入量。此外,該問答中回應了對“ALARP”原則的質疑,表示如果藥物中的基因毒性雜質經(jīng)考察已經(jīng)低于規(guī)定的限度,則無需采用“ALARP”原則繼續(xù)降低藥物中基因毒性雜質的殘留量,由此有效降低了分析方法建立或者轉移帶來的挑戰(zhàn)。美國食品藥品監(jiān)督管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)[11]于2008年12月也出臺了有關原料藥和制劑中基因毒性雜質控制的指南草案(Guidance for industry-genotoxic and carcinogenic impurities in drug substances and products: recommended approaches)。該草案與EMA頒布的限度指南在服藥周期超過1個月至終生服藥時所涉及的TTC限度要求完全一致,而在服藥周期短于1個月的具體階段化TTC值規(guī)定則有所不同。ICH (the International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)[12]于2014年7月15日正式發(fā)布了基因毒性雜質研究指南(M7),并在多次修改后于2017年5月31日出臺了第四版指南M7(R1),進一步肯定了上述各方采用“階段化TTC”以及“五分類”策略對基因毒性雜質進行研究和控制的科學性,并在這些策略的基礎上做了一定的調整和增補。

表2對比顯示了各監(jiān)管機構及PhRMA對于基因毒性雜質的控制要求?？梢钥吹紼MA和FDA的規(guī)定最為細致,且兩者對于具有1個月以上服藥周期的藥物監(jiān)管要求完全一致,而ICH的監(jiān)管要求相對而言較為寬松。在同樣12個月的服藥周期內(nèi),EMA和FDA都規(guī)定了每天不得超過5 μg的限度,而ICH的要求放寬到20 μg。在服藥周期12月以上時,PhRMA、EMA和FDA規(guī)定基因毒性雜質每天的可接受攝入量不得過1.5 μg,而ICH則要求只有服藥周期10年以上時,才需限定每日攝入的基因毒性雜質不得超過1.5 μg。究其原因,可能是由于ICH作為多方協(xié)調機構,兼顧了多國的技術可行性。

PhRMA: pharmaceutical research and manufacturers of America; EMA: European Medicines Agency; FDA: U. S. Food and Drug Administration; ICH: the International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.

針對藥物中存在多個誘變性雜質的情況,M7(R1)也提出了相應的監(jiān)管要求。當藥物中含有多個1類雜質時,應根據(jù)每個雜質的特定限度分別對其進行控制。當藥物中含有兩個2類或3類雜質時,每個雜質的控制仍然按照“階段化TTC”的原則控制,即藥物中的每個雜質限度必須滿足表2的規(guī)定;然而,如果藥物中存在3個及以上2類或3類雜質,每個雜質的可接受攝入量在滿足表2所述限度的同時,所有雜質的總量還需要根據(jù)表3進行限定。

與歐美發(fā)達國家相比,我國基因毒性雜質的研究尚處于起步階段,目前也沒有直接出臺相關的指南,但是在當下藥物研發(fā)全球化趨勢下,特別自2017年6月我國加入ICH組織以來,我國藥監(jiān)部門主要是參照上述國際主流指南開展藥物中的基因毒性雜質的審批與監(jiān)管,以保證藥物質量的可控性與臨床應用的安全性。

2 磺酸酯類基因毒性雜質研究進展

由于藥物與磺酸成鹽后具有溶解度增加、溶解速率加快、穩(wěn)定性增強、引濕性降低以及晶型更穩(wěn)定等優(yōu)點,且磺酸鹽藥物在改善有機弱堿性藥物的機械性質,諸如流動性、黏合性、可壓縮性等方面也具有獨特的優(yōu)勢,因此通過與磺酸成鹽是一種提高有機弱堿藥物成藥性的重要手段[13]。據(jù)統(tǒng)計,目前處于臨床研發(fā)階段和已經(jīng)上市的磺酸鹽藥物有兩百余種(見表4),治療病癥包括嘔吐、哮喘、血栓、細菌感染、中風、癌癥、艾滋病、抑郁癥等類型[14],由此可見磺酸鹽藥物的開發(fā)和市場應用具有一定的普遍性和廣泛性。磺酸鹽藥物由磺酸和藥物自由堿通過成鹽反應得來,在合成過程中用到低級醇類溶劑(甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇等)時,磺酸就可能與這些醇類溶劑發(fā)生副反應產(chǎn)生磺酸酯雜質。早在2000年,歐洲藥品質量管理局(European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM)即要求密切關注磺酸鹽藥物在成鹽過程中形成基因毒性雜質磺酸酯的潛在風險,并且要求除了要對甲磺酸鹽中的烷基磺酸酯進行限度檢查外,還要提供其他相關的研究信息[15]。在這之后發(fā)生的甲磺酸奈非那韋因甲磺酸乙酯超標而遭到撤市的事件[16],更是成為觸發(fā)歐洲藥監(jiān)部門和制藥企業(yè)高度關注磺酸酯基因毒性的標志性事件。Roche公司通過對生產(chǎn)工藝的調查,發(fā)現(xiàn)甲磺酸乙酯殘留超標的原因是甲磺酸貯存罐清洗所用的乙醇未被完全清除,以較高的濃度水平殘留在貯存罐中,與存放其中的甲磺酸反應生成了甲磺酸乙酯。在Roche公司解決了甲磺酸乙酯污染問題并對其毒性進行評估后,歐洲藥品評價局才恢復了甲磺酸奈非那韋在歐洲的市場授權。該事件的發(fā)生不僅極大地危害了病人的健康,也給Roche公司造成了巨大的經(jīng)濟損失。

/: not reported.

除了磺酸和醇可能生成磺酸酯以外,磺酸的衍生物在與醇類溶劑共存時也可能會發(fā)生副反應從而產(chǎn)生磺酸酯。如磺酰氯、磺酸酐等,其化學性質活潑,在藥物合成中具有非常廣泛的用途,可作為良好的離去基團、某個化學結構基團的保護基團等參與化學反應;而且這些衍生物在重要的藥物合成前體——磺酰胺類化合物的合成中以及手性異構體藥物的分離中也起著非常重要的作用,在這些化學反應中,假如同時使用醇溶劑,就可能會發(fā)生副反應而產(chǎn)生磺酸酯[17](見圖2)。

圖 2 磺酸、磺酸鹵化物、磺酸酐與低相對分子質量醇反應生成磺酸酯示意圖Fig. 2 Schematic generation of sulfonate esters between sulfonic derivatives and low relative molecular mass alcohols X=OH, Cl, Br, I, OSO2R; R=alkyl, phenyl; R′=alkyl.

由于醇類溶劑和磺酸及其衍生物的種類多樣,因此由兩者生成的磺酸酯包含多種結構,從最簡單的烷基磺酸酯到復雜的芳基磺酸酯,主要有:甲磺酸酯,如甲磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯;苯磺酸酯,如苯磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯;對甲苯磺酸酯,如對甲苯磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯;三氟甲磺酸酯,如三氟甲磺酸甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯等(見圖3)。研究表明,磺酸酯具有誘變性,能夠直接或者經(jīng)代謝活化后間接地將自身結構上的烷基殘基轉移到富電子的DNA堿基上而引起DNA的烷基化,從而導致遺傳物質的損傷[18,19]。

2.1 磺酸酯的形成機理及控制策略

圖 3 磺酸酯的種類Fig. 3 Categories of sulfonate esters

圖 4 甲磺酸和甲醇反應機理[20]Fig. 4 Reaction mechanism between methanesulfonic acid and methanol[20]

由葛蘭素史克、阿斯利康等藥企研發(fā)人員組成的藥物質量研究所工作組在Teasdale領導下,利用同位素(18O)標記的方法,探究了甲磺酸和甲醇反應生成甲磺酸甲酯的機理[20]。起初Teasdale等推測甲磺酸和甲醇的反應機理有兩種可能途徑(見圖4),然而同位素測定結果顯示只在產(chǎn)物水中檢測到了18O,而產(chǎn)物甲磺酸酯中并不存在18O,說明甲磺酸和甲醇反應生成甲磺酸甲酯的機理為圖4中所示的途徑A,即首先甲磺酸釋放質子,形成甲磺酸根離子,同時甲醇質子化形成氧鎓離子,然后甲磺酸根離子對該氧鎓離子進行親核進攻,生成甲磺酸甲酯和水。該反應機理揭示了磺酸和醇反應生成磺酸酯需要一定的酸性環(huán)境。接著Teasdale等[21]又繼續(xù)探討了反應溫度,體系中的水分含量,溶液酸度等因素對磺酸酯生成和消除的影響,結果表明降低反應溫度能顯著降低磺酸酯形成的速率和相應產(chǎn)生的磺酸酯的水平;縮短醇和甲磺酸的反應時間、增加水分的含量、增大反應體系的pH也能夠有效減少磺酸酯的生成。他們的研究提供了盡可能降低磺酸酯水平的控制策略[22]:在磺酸鹽藥物成鹽過程中,盡量按照化學計量比投加磺酸和自由堿,同時為了促進向成鹽反應的正向進行,采取加入過量自由堿而非磺酸的方式使反應體系呈弱堿性,從而消除磺酸酯生成的風險;如果必須要使用過量的磺酸,應盡可能減少其用量并在較低的溫度下進行成鹽反應以及后續(xù)的分離操作,降低磺酸酯生成的速率;減少成鹽反應和重結晶所用的時間,以此減少磺酸和醇類溶劑共存發(fā)生反應的時間;向成鹽反應和后續(xù)分離步驟所用的溶液中添加適量的水,減少質子化醇的濃度,使酯化平衡反應向逆反應方向移動以加速磺酸酯的水解;避免磺酸和醇在使用前預先混合和儲存的情況。這些策略為磺酸鹽藥物合成中磺酸酯的有效控制提供了重要參考,當然要注意到這些措施可能對反應收率帶來負面影響,需要在權衡各控制措施對藥物合成帶來的利弊基礎上進行合理選擇與優(yōu)化。

2.2 磺酸酯相關分析方法

為了確保藥物的質量安全,有必要建立準確、耐用的分析檢測方法,對藥物中殘留的磺酸酯進行定量測定并及時與合成工藝人員進行反饋交流,以確保工藝路線的合理安全。目前文獻[23-43]報道的磺酸酯的分析方法主要有液相色譜(HPLC)法和氣相色譜(GC)法,相關方法的回收率和檢出限總結于表5中。

2.2.1液相色譜法

非揮發(fā)性的磺酸酯可采用HPLC進行分析,其中具有紫外吸收的磺酸酯的檢測可采用紫外(UV)檢測器。為了提高檢測靈敏度,常常會進一步選用選擇性和靈敏度更高的質譜(MS)檢測器。Zheng等[23]利用LC/UV法檢測奧格列汀原料藥中的苯磺酸異丙酯,以220 nm作為測定波長,以添加0.1% (體積分數(shù))乙酸的水/乙腈(65∶35, v/v)作為流動相。該方法的檢出限和定量限分別為0.33 mg/L 和1 mg/L。由于磺酸酯具有遇水易分解的特性,因此在采用LC法進行磺酸酯測定時,需要特別關注磺酸酯的溶液穩(wěn)定性[24-26],否則可能導致假陰性的檢測結果。Kakadiya等[27]采用電噴霧電離(ESI)源,建立了LC/MS/MS法分別檢測洛匹那韋和利托那韋原料藥中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯,檢出限約為2 μg/L,回收率在80% ～120%之間。陳成等[28]則采用了大氣壓化學電離(APCI)源檢測2-脫氧-D-核糖中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯,該方法的檢出限為4 μg/L,回收率為91.7% ～113.1% 。Guo等[29]進一步對APCI和ESI這兩種電離源進行了對比,結果發(fā)現(xiàn)采用ESI時,方法的靈敏度和重現(xiàn)性較差。相較而言,采用APCI電離方式的負離子模式,各待檢磺酸酯的靈敏度較高,因此作者最終選用APCI方式用于甲磺酸伊馬替尼和長春西汀原料藥中磺酸酯的檢測,方法靈敏度在2 μg/L 左右,回收率在93% ～118%之間。針對復雜藥物基質,采用液液萃取等樣品前處理方式可以減少輔料等帶來的干擾。Cappiello等[30]在檢測對乙酰氨基酚片中的對甲苯磺酸甲酯等烷基化試劑時,采用四氫呋喃作為萃取溶劑,然后采用電子轟擊(EI)電離源的LC/MS法進行檢測,回收率在55% ～82%之間,可以看出該方法的準確性波動較大。

表 5 文獻報道的磺酸酯檢測方法的檢出限及回收率匯總

IBS: isopropyl benzenesulfonate; MBS: methyl benzenesulfonate; EBS: ethyl benzenesulfonate; BBS: butyl benzenesulfonate; MTS: methylp-toluenesulfonate; ETS: ethylp-toluenesulfonate; ITS: isopropyl p-toluenesulfonate; MMS: methyl methanesulfonate; EMS: ethyl methanesulfonate; PMS: propyl methanesulfonate; IMS: isopropyl methanesulfonate; PBS: propyl benzenesulfonate; PTS: propylp-toluenesulfonate; DMS: dimethyl sulfate; DES: diethyl sulfate; DPS: dipropyl sulfate; DIPS: diisopropyl sulfate; API: active phamaceutical ingredient; SM934: an artemisinin derivative.

由于磺酸酯屬于酯類結構,在含水的流動相中可能會發(fā)生水解等問題而影響測定結果的準確性,因此利用化學衍生化的方式將其轉化為穩(wěn)定的物質是解決磺酸酯在線水解問題的一種較好的方式。An等[31]建立了衍生化LC/MS法檢測甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丙酯、甲磺酸異丙酯、苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸異丙酯、對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸丙酯、對甲苯磺酸異丙酯、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丙酯和硫酸二異丙酯等多種烷基酯類基因毒性雜質,采用10%(體積分數(shù))三甲胺水溶液作為乙酯、丙酯和異丙酯的衍生化試劑,10%(體積分數(shù))三乙胺水溶液作為甲酯的衍生化試劑,在50～60 ℃條件下孵育60 min,衍生為較穩(wěn)定的季銨鹽,采用HILIC(hydrophilic interaction chromatography)親水色譜柱進行方法學的開發(fā)和驗證。但是該衍生化方法所得到的衍生產(chǎn)物的色譜峰出現(xiàn)了較為明顯的拖尾現(xiàn)象,而且該方法對于不同待測物的準確性有比較大的差異,表現(xiàn)為回收率跨度較大,如苯磺酸丙酯的回收率為85% ,而苯磺酸乙酯的回收率高達137% 。Zhou等[32]則利用N,N-二乙基二硫代氨基甲酸作為衍生化試劑,向待測甲磺酸甲酯和乙酯中引入生色基團進行柱前衍生,采用UV檢測器進行檢測。但該衍生化時間較為冗長,需耗時60 min。

2.2.2氣相色譜法

為了避免在采用LC法檢測磺酸酯時出現(xiàn)遇水易分解現(xiàn)象,具有一定揮發(fā)性或者半揮發(fā)性的磺酸酯可以采用GC進行檢測,并采用氫火焰離子化檢測器(FID)或者MS檢測器。Li[33]和鄭飛等[34]均采用直接進樣GC/FID法檢測原料藥中的甲磺酸甲酯、乙酯和異丙酯,進樣量為5 μL,進樣口溫度為120 ℃。該方法由于引入大量的非揮發(fā)性藥物基質,容易污染進樣口,因此需要及時更換襯管。此外,該方法由于采用FID檢測器,靈敏度較低,僅能檢測40 μg/L 及以上的磺酸酯。Ramakrishna等[35]報道了采用直接進樣GC/MS法來測定甲磺酸伊馬替尼中的甲磺酸甲酯和乙酯,以正己烷作為樣品溶劑,采用DB-1色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度設定為140 ℃,進樣量為2 μL,分流比為200∶1,其檢出限和定量限分別為0.3和1.0 mg/L,在1～15 mg/L 范圍內(nèi)的回收率為98.1% ～99.6% 。Zhang等[36]也報道了直接進樣GC/MS法來對甲磺酸伊馬替尼中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯進行定量分析。與上述Ramakrishna等建立的方法不同,該方法采用水飽和的正己烷作為樣品溶劑,以HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)為色譜柱,得到的靈敏度更高,檢出限為1 μg/L,定量限為5 μg/L,在10～1 000 μg/L 范圍內(nèi)的準確度為97.2% ～99.8% 。該方法同時還提高了進樣口溫度(200 ℃),分流比也減小到100∶1。通過對比上述Zhang等與Ramakrishna等的研究工作,提示了樣品溶劑、進樣口溫度和分流比等條件的優(yōu)化對于提高磺酸酯檢測方法的靈敏度至關重要。

雖然直接進樣操作簡單,但由于會因此引入大量非揮發(fā)性基質而導致色譜系統(tǒng)污染從而出現(xiàn)平行性異常等問題,研究人員嘗試了固相微萃取(SPME)、液液萃取(LLE)作為樣品前處理方式的GC/MS法來檢測藥物中的磺酸酯。Colón等[37]建立了直接浸入式SPME-GC/MS的方法對藥物中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯進行限度檢查,采用弱極性的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)為固定相的微萃取頭,以20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 4.7)作為樣品溶劑,在該pH條件下藥物基質被離子化而增大了極性,不易被固定相萃取從而減小了基質效應。Wollein等[38]采用LLE的樣品前處理方式檢測藥物固體制劑中的甲磺酸甲酯、乙酯、丙酯以及苯磺酸甲酯和乙酯,測得檢出限和定量限分別小于5和20 μg/L。由于該方法采用非極性的正己烷作為萃取溶劑,因此不適用于極性較大的藥物中磺酸酯的測定。

盡管SPME、LLE能在一定程度上降低基質效應,但操作繁瑣,耗時耗力而且磺酸酯在進樣口和襯管中的熱降解問題并沒有得到解決,因此,研究人員進一步采用頂空衍生化的方式,將反應性的磺酸酯衍生為較為穩(wěn)定的、揮發(fā)性的物質。Lee等[39]采用硫氰酸鈉作為衍生化試劑,以水為溶劑,建立了頂空GC/MS方法檢測一種甲磺酸鹽中的甲磺酸甲酯、乙酯和異丙酯。然而該衍生方法會產(chǎn)生異構化的產(chǎn)物(烷基硫氰酸和烷基異硫氰酸),從而不利于進行定量測定,而且該方法僅僅局限于水溶性藥物,不適用于水溶性較差的藥物中磺酸酯的檢測。Alzaga等[40]采用五氟苯硫酚作為衍生化試劑(其溶劑為水和二甲亞砜混合溶液),將磺酸酯衍生為五氟苯硫醚,采用頂空GC/MS檢測。在方法驗證的過程中發(fā)現(xiàn),該方法的準確性(尤其是對甲苯磺酸甲酯)會明顯受到基質的影響,檢測樣品A中的對甲苯磺酸甲酯的回收率僅有40% ,而對甲苯磺酸乙酯和異丙酯的回收率均大于93% ;樣品B中所有酯的回收率則在85%和100%之間。歐洲藥典(EP)[41]也描述了一種在線衍生化頂空GC/MS法檢測甲磺酸倍他司汀、苯磺酸氨氯地平和對甲苯磺酸舒他西林原料藥中的痕量甲磺酸酯、苯磺酸酯和對甲苯磺酸酯。采用碘化鈉(NaI)作為衍生化試劑,利用碘離子的親核性,將磺酸酯在線衍生為不同種類的碘代烷烴,經(jīng)GC/MS進行分析檢測。該方法因衍生化反應操作簡便,具有較好的通適性而受到分析人員的青睞。范達等[42]采用了該衍生化方法檢測注射用甲磺酸吉米沙星中的甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯,以電子捕獲檢測器(ECD)代替了MS檢測器。發(fā)現(xiàn)該方法對于不同磺酸酯的檢測靈敏度差異較大,其中甲磺酸甲酯的靈敏度最高,檢出限為0.002 μg/L,甲磺酸異丙酯的靈敏度最低,檢出限為0.25 μg/L。Liu等[43]發(fā)現(xiàn)EP采用的用于防止NaI氧化的抗氧劑硫代硫酸鈉對方法的耐用性具有不利影響,在延長頂空平衡時間和升高平衡溫度時會造成對甲苯磺酸甲酯的衍生產(chǎn)物碘甲烷(MeI)的降解。研究發(fā)現(xiàn)選用維生素C作為替代抗氧劑,能夠在較高的平衡溫度和較長的平衡時間下保持包括MeI在內(nèi)的衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性,并提高了該方法的耐用性并擴展了相應的應用范圍,檢測限和定量限可以分別達到0.6和2 μg/L。

3 總結與展望

近年來有關藥物中的基因毒性雜質的控制得到來自于藥物監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機構的高度重視,基于風險管理的“階段化TTC”控制策略,使得基因毒性雜質的控制更趨科學合理?；撬狨プ鳛橐活愝^為常見的基因毒性雜質,可以通過對關鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化與設計進行有效控制,符合當下“質量源于設計”的理念,即良好的工藝設計往往能促進高質量藥物的生產(chǎn),并在充分保障藥物安全性的基礎上盡可能減少企業(yè)的研發(fā)投入及相應的政府監(jiān)管成本。

由于基因毒性雜質在藥物中的控制較為嚴格,通常在μg/L甚至接近ng/L水平,因此需要建立高靈敏度的定量檢測方法,其中需要綜合考慮藥物基質以及待測磺酸酯的揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性以及化學反應特性等,有的放矢地建立滿足靈敏度需求的檢測方法。