陳盛楠，陳奎蓉，趙雯娟，楊永磊，趙一蘋，曹素芳

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450046)

豬繁殖與呼吸綜合征( PRRS)俗稱豬“藍(lán)耳病”，其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRS最早發(fā)生于美國，隨后蔓延于世界。我國1996年出現(xiàn)該病。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV易變異，2006年我國就出現(xiàn)了由經(jīng)典PRRSV演化而來的高致病性PRRSV[1]，其毒力大大增強(qiáng)，主要表現(xiàn)是體溫高燒不下、呼吸障礙、死亡率高。目前，豬場內(nèi)除了高致病PRRSV，經(jīng)典PRRSV、疫苗株外，還有PRRSV類NADC30株、重組毒株等，不同毒株引發(fā)的臨床癥狀嚴(yán)重程度不同，各毒株間也可發(fā)生重組導(dǎo)致新的毒株。2014年以來，PRRSV類NADC30株已成為我國豬場主要流行毒株[2]，其提高母豬流產(chǎn)率，加重保育豬及育肥豬的呼吸道癥狀，還常引發(fā)其它病原微生物混合或繼發(fā)感染，死亡率大大增加，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

PRRSV為單股正鏈 RNA有囊膜病毒,基因全長約為15～15.5kb，至少含有ORF1a、ORF1a′、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6及ORF7等11個開放閱讀框 (open readingframe,ORF)[3]。最容易變異的存在于ORF1a中的nsp2基因，它編碼最大的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2[4]。研究顯示，在高致病性PRRSV中的Nsp2蛋白含有30個氨基酸的不連續(xù)缺失[5]，但在PRRSV類NADC30株中，Nsp2則以“111+1+19”模式缺失131個氨基酸[6]。為了了解湖北地區(qū)某豬場PRRSV毒株流行情況，掌握該毒株的nsp2遺傳變異特點，本試驗采用RT-PCR法擴(kuò)增湖北分離株(命名為HDZZ1株)的nsp2基因，并對獲得的基因序列進(jìn)行遺傳變異分析，為設(shè)計和開發(fā)更有效的PRRSV 診斷制劑提供技術(shù)支持，為早期預(yù)警 PRRS 的發(fā)生和流行提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

PRRSV陽性病料(湖北某豬場)；TRIzolRegment(Invitrogen公司)；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin(Promega公司)；EX taq DNA聚合酶等PCR試劑、DL2000 Maker、MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit Ver 4.0膠回收試劑盒(上海生工)。

1.2 引物的設(shè)計與合成

參照Genbank中登錄的HP-PRRSV基因序列及文獻(xiàn)[8]，設(shè)計nsp2引物：nsp2-F：5′-CCTCCGTGGTGCAACAAATCTTG-3′；nsp2-R：5′-CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT-3′，擴(kuò)增片段約為1065bp。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增

1.3.1 病毒培養(yǎng) 將采集的病料進(jìn)行處理后，接種Marc-145細(xì)胞，六次傳代后，待細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，離心，取上清備用。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TRIzolRegment試劑盒說明書進(jìn)行提取病毒總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系20μL：模板RNA 12.5μL，AMV RT 5X Buffer 4μL，4dNTP 1μL，RNasin 0.5μL，上下游引物各1μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL, 42℃水浴60 min，冰浴5min，取出即得cDNA。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為25μL：10×Ex TaqBuffer2.5μL，上下游引物各0.5μL，4dNTP 0.5μL，cDNA模板1μL，Ex Taq0.5μL，ddH2O 19.5μL。nsp2基因擴(kuò)增條件為：94℃ 5min；94℃30s、56℃ 30s、72℃ 45s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.4 序列測定及分析 用MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit Ver 4.0膠回收試劑盒,將目的條帶回收后送至上海生工進(jìn)行測序。對獲得的序列與Genbank中的序列進(jìn)行同源性分析，其中選取13株高致病性毒株(07BJ、BJ0708、GD、GDYC、HEB1、Henan-1、HN-HW、HPBEDV、HUB1、HUN4、JXA1、SX-1、SX2009)、美洲代表株VR-2332、4株美洲經(jīng)典型(CH-1a、CC-1、BJ-4、S1)、疫苗毒株(MLV)、美國NADC30株(JN654459.1)、國內(nèi)NADC30-like型HNjz15株(KT945017.1)及歐洲代表株Lv共22株(表1)，應(yīng)用Lasergene R7.0 (DNAStar) 和DNAMan軟件對毒株序列進(jìn)行多重比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 同源比較的22參考株P(guān)RRSV信息

2 結(jié)果

2.1 目的基因RT-PCR結(jié)果

應(yīng)用RT-PCR獲得了HDZZ1株的nsp2部分基因，結(jié)果顯示,與預(yù)期大小一致的片段(圖1)序列大小約為1065bp。

圖1 HDZZ1株Nsp2基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DL2000；Nsp2：nsp2片段

2.2 PRRSV HDZZ1株Nsp2部分基因核苷酸及其編碼氨基酸的序列分析

2.2.1 核苷酸同源性分析 將HDZZ1株nsp2與PRRSV歐洲型毒株Lv的Nsp2部分基因的核苷酸序列對比，發(fā)現(xiàn)同源性為39.5%，與PRRSV疫苗株MLV同源性為77.5%，與美洲原型毒株VR-2332的同源性為77.7%，與4株經(jīng)典毒株CH-1a、CC-1、BJ-4、S1的同源性分別為90.8%、77.6%、77.4%、77.1%，與美國NADC30株的同源性為54.4%，與國內(nèi)NADC30-like型HNjz15株的同源性為55.1%，而與13株高致病毒株07BJ、BJ0708、GD、GDYC、HEB1、Hennan-1、HN-HW、HPBEDV、HUB1、HUN4、JXA1、SX-1、SX2009的同源性分別為98.5%、98.3%、98.8%、98.6%、97.6%、97.3%、98.3%、98.3%、97.7%、98.3%、98.2%、96.4%、96.5%。分析結(jié)果顯示：HDZZ1毒株為高致病性PRRSV(圖2)。

圖2 分離毒株與參考毒株Nsp2核苷酸序列同源性對比

2.2.2 核苷酸序列差異分析 HDZZ1株與美洲原型毒株VR-2332和經(jīng)典毒株CH-1a進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2處不同位置的連續(xù)缺失，缺失基因位于694bp～696bp和850bp～936bp，共90個堿基。與美國NADC30株、國內(nèi)NADC30 HNjz15株比較，發(fā)現(xiàn)14處不同位置的基因缺失和6處不同位置的基因添加，基因缺失分別位于37bp～40bp、51bp、86bp～87bp、103bp～106bp、187bp～194bp、210bp～214bp、281bp、396bp、408bp、427bp～428bp、694bp、783bp～785bp、850bp、908bp～936bp，共60bp，基因添加分別位于245bp～246bp、337bp～340bp、499bp～500bp、540bp、796bp、843bp～845bp，共13bp。與以JXA1為代表的高致病性PRRSV基因缺失或基因添加的位置一致(如圖3)。

圖3 分離株與PRRSV參考株Nsp2基因序列對比結(jié)果

2.2.3 推導(dǎo)氨基酸序列同源性分析 HDZZ1株與PRRSV歐洲型毒株Lv的Nsp2部分基因的同源性為14.5%，與PRRSV疫苗株MLV的Nsp2部分基因同源性為68.1%。與美洲原型毒株VR-2332的Nsp2部分基因的同源性為68.9%。與22株P(guān)RRSV美洲型毒株nsp2部分基因的氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HDZZ1株與4株經(jīng)典毒株CH-1a、CC-1、BJ-4、S1的同源性分別為87.6、69.7%、67.8%、67.2%，與13株高致病07BJ、BJ0708、GD、GDYC、HEB1、Hennan-1、HN-HW、HPBEDV、HUB1、HUN4、JXA1、SX-1、SX2009的同源性分別為97.7%、97.2%、98.3%、98.0%、95.8%、94.9%、97.2%、96.9%、96.3%、97.2%、96.9%、94.4%、94.4%，見圖4。

圖4 分離毒株與參考毒株Nsp2氨基酸序列同源性對比

2.2.4 推導(dǎo)氨基酸序列差異分析 HDZZ1株與美洲原型毒株VR-2332和經(jīng)典毒株BJ-4進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在氨基酸缺失上：1處氨基酸單個缺失和1處氨基酸連續(xù)缺失，缺失氨基酸位于222位和274位～302位，共30個氨基酸，與江西省所分離的PRRSV JXA1株的Nsp2氨基酸缺失情況完全相同(圖5紅框所圈)；在氨基酸突變上：與美洲原型毒株VR-2332相比有127處差異，與高致病性毒株P(guān)RRSV JXA1株對比，第6位S→N，第37位V→E，102位E→G，第225位G→D，第228位N→I，第237位T→K，第245位V→M，第256位T→K，第270位T→I，第293位E→G，第330位A→T，共11處差異(圖5藍(lán)框所圈)。

2.3 構(gòu)建Nsp2序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

將該地區(qū)PRRSV分離株HDZZ1與其他地區(qū)PRRSV分離毒株的Nsp2氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建與分析。結(jié)果表明，該分離毒株與其他高致病性PRRSV毒株(如JXA1、07BJ等)位于同一大分支中，親緣關(guān)系比較近，其中與北京株(07BJ)關(guān)系最近，但與國內(nèi)較早分離的經(jīng)典病毒株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。與歐洲代表株(Lv)、美國NADC30株和國內(nèi)NADC30-like型HNjz15株處于不同分支中，可見親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)(見圖6)。

圖5 分離株與PRRSV參考株Nsp2氨基酸序列對比結(jié)果

圖6 分離株與PRRSV參考株Nsp2序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

2.4 推導(dǎo)蛋白質(zhì)親水性和疏水性的對比

分離株HDZZ1 Nsp2部分氨基酸與GenBank已登錄的高致病性PRRSV進(jìn)行親水性和輸水性對比，發(fā)現(xiàn)其與高致病性并無較大差異(圖7和圖8)。

3 討論

豬繁殖與呼吸道綜合征是造成我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。我國自2006年報道由PRRSV變異毒株引起的高致病性豬繁殖與呼吸道綜合征以來，多地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了PRRSV的變異毒株，并且臨床上呈現(xiàn)持續(xù)感染、適應(yīng)力不斷增強(qiáng)的趨勢[7,8]。許多研究發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典型PRRSV相比，高致病性PRRSV存在著30個氨基酸不連續(xù)的缺失，以此推測這就是高致病性PRRSV的重要特征，但經(jīng)后續(xù)的實驗證明，該氨基酸缺失與毒力無直接關(guān)系[9,10]，但在病毒的復(fù)制和宿主免疫調(diào)節(jié)這兩方面有著重要的作用。

圖7 分離株與高致病性PRRSV推導(dǎo)氨基酸親水性對比結(jié)果

圖8 分離株與高致病性PRRSV推導(dǎo)氨基酸疏水性對比結(jié)果

目前，常用PCR法檢測豬場PRRSV感染情況，檢測靶基因一是選擇結(jié)構(gòu)基因ORF5和ORF7[11,12]，另一個是以最易變異的nsp2基因為靶基因[13]。由于以nsp2基因為靶基因進(jìn)行PCR檢測可以區(qū)分經(jīng)典PRRSV毒株、HP-PRRSV毒株及PRRSV類NADC30毒株等不同亞型和亞群[14]。因此，本實驗設(shè)計了nsp2基因高變區(qū)的特異性引物，以分離湖北某豬場的毒株HDZZ1為模板，擴(kuò)增獲得了nsp2部分高變區(qū)基因，經(jīng)序列測定及變異分析，結(jié)果顯示，分離毒株HDZZ1與2006年以來發(fā)現(xiàn)的高致病性PRRSV相同，均存在90個核苷酸不連續(xù)缺失，分別為第481和533～561位，與Genbank登記的高致病性PRRSV核苷酸序列同源性高達(dá)96.4%，與美國NADC30株、國內(nèi)NADC30型HNjz15株比較，同源性為55%，說明HDZZ1毒株為高致病性PRRSV，而不屬于NADC30毒株，與曹素芳等[14]研究結(jié)果一致。推導(dǎo)的氨基酸序列表明，獲得的Nsp2蛋白氨基酸序列具有高致病性毒株的經(jīng)典缺失，即30個不連續(xù)氨基酸缺失，與白云等[15]研究結(jié)果不一致，可能是不同地區(qū)PRRSV流行毒株有差異。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，HDZZ1毒株與高致病性PRRSV同屬一分支，與北京株(07BJ)關(guān)系最近，再次證明該毒株為高致病性PRRSV，但該毒株的毒力是否比其他毒株更強(qiáng)，還需進(jìn)一步深入研究。