肖鵬，張曉，靳超

（鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院，河南 洛陽 471009）

肺腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），占肺癌總數(shù)的85%，是肺癌最常見的組織學(xué)類型。該病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病率和死亡率均很高，其中死亡率平均每年增長約7.7%[1]。肺腺癌發(fā)病多見于女性，術(shù)后5年生存率≤10%。早期肺腺癌因癌細(xì)胞侵襲程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)率均較小，首選治療方式為肺葉切除聯(lián)合淋巴結(jié)清掃術(shù)。程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）作為生物標(biāo)志物，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2015年批準(zhǔn)兩種免疫抑制劑應(yīng)用于NSCLC的臨床治療中[2]，說明其對(duì)肺癌的治療起到重要的作用。本文探討PD-L1的表達(dá)對(duì)I期肺腺癌經(jīng)電視胸腔鏡下解剖性肺段切除聯(lián)合系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)后結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年4月-2012年12月該院經(jīng)手術(shù)活檢確診并經(jīng)接受治療的86例Ⅰ期浸潤性肺腺癌患者，腫瘤直徑大小≤3 cm。其中，男性54例，女性32例；年齡25～76歲，平均59.3歲，中位年齡62歲。按照國際肺癌研究會(huì)（international association for the study of lung cancer, IASLC）最新發(fā)布的第7版關(guān)于肺癌TNM分期診斷標(biāo)準(zhǔn)：ⅠA期49例，ⅠB期37例；按照美國東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative oncology, ECOG）體能狀況評(píng)分在0～2分；所有患者均為周圍型。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受電視胸腔鏡下解剖性肺段切除聯(lián)合系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)的Ⅰ期肺腺癌；②有病理學(xué)診斷依據(jù)，同時(shí)結(jié)合PET-CT及臨床癥狀檢查；③KPS評(píng)分≥70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有心、肝、腎及腦部等嚴(yán)重疾?。虎谄渌愋偷姆伟?；③治療過程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或者不可逆的4級(jí)毒性反應(yīng)；④有放化療禁忌證且3個(gè)月內(nèi)接受放化療治療；⑤依從性差或任何原因?qū)е碌牟荒芾^續(xù)接受治療。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 所有患者術(shù)前需要行常規(guī)檢查（如心電圖、肺功能檢測(cè)及胸腹部CT），對(duì)部分患者行CT三維重建，確定靶段血管、支氣管有無變異。對(duì)確診為肺癌的患者行頭部MRI及全身核素骨顯像檢查，從而排除肺外轉(zhuǎn)移。小結(jié)節(jié)病例術(shù)前行CT定位、注入亞甲藍(lán)并置入定位鋼絲，提高準(zhǔn)確率及手術(shù)成功率。所有受試對(duì)象均給予雙腔氣管插管進(jìn)行麻醉、單肺通氣，取健側(cè)90°臥位，腋下墊枕，調(diào)整手術(shù)床為折刀位。于腋前線第7肋間，切長約1.5 cm切口作為觀察孔；在腋前線第4、5肋間切長約3～5 cm切口作為主操作孔；于腋后線第7、8或8、9肋間切長約1.5 cm切口作為副操作孔。采用電凝鉤或超聲刀解剖分離靶段靜脈、動(dòng)脈及支氣管，在電視胸腔鏡下用直線切割縫合器閉合切斷。靶段與臨近肺段交界的確定：①待靶段支氣管夾閉后張肺，確定未涉及的其余肺段；②靶段支氣管夾閉后張肺，靶段所在肺葉膨脹后單肺通氣，其余肺段肺塌陷、與充氣的肺段之間形成界限，沿此界限采用直線切割器切斷。手術(shù)中需要注意事項(xiàng)為：①確定具有足夠的切緣，切緣在≥1 cm或切緣/腫瘤直徑=1 cm；②術(shù)中需要將縱隔、肺門、葉間、段間淋巴結(jié)及靶段、切緣快速冷凍送檢，若淋巴結(jié)陽性則改為肺葉切除術(shù)；③淋巴結(jié)清掃范圍主要包括N2、N1和靶段的11、12及13組；④術(shù)中需預(yù)防剩余肺段扭轉(zhuǎn)，縫合或切割縫合器固定。

1.2.2 臨床資料收集 收集患者臨床資料[年齡、性別、臨床癥狀（包含咳嗽、痰血、低熱及胸痛或胸悶等）、吸煙史、家族史、胸膜受累、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、術(shù)后ECOG評(píng)分、病理類型（鱗屑樣、腺泡樣、乳頭狀、實(shí)性和微乳頭狀）及術(shù)后是否進(jìn)行輔助治療等]。術(shù)前CT掃描診斷肺腺癌患者磨玻璃樣影（pure ground glass opacity, GGO），按照結(jié)果分為純GGO、混合GGO及實(shí)行結(jié)節(jié)。其中純GGO是指輕微且均勻的密度增加，但未掩蓋肺內(nèi)血管；混合GGO則為GGO合并實(shí)性成分；純實(shí)性結(jié)節(jié)則僅為固體成分，無任何磨玻璃外觀。

1.2.3 外周血標(biāo)本的收集及處理 所有患者均在術(shù)后第7天清晨，空腹并抽取肘靜脈血3 ml，7℃放置0.5 h后以2 500 r/min離心15 min，分離血清后于-40℃冰箱中冷凍保存。抽取患者肘靜脈血時(shí)需要記錄患者的臨床診治及隨訪情況。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè) 血清中sPD-L1水平將抗體包被稀釋至所需要濃度，并按100 μl/孔加入到96孔板中，密封室溫過夜，洗滌、吸干。每孔再加入300 μl的試劑稀釋液，室溫孵育至少1 h。洗滌、吸干后，每孔加入100 μl的樣品封蓋，室溫孵育2 h。洗滌吸干后，每孔加入100 μl含有2% N-氯化丁二酰亞胺的檢測(cè)抗體，蓋板室溫孵育2 h。洗滌吸干后，加入100 μl的顯色劑，避光、室溫孵育20 min。將上述液體保留并加入50 μl終止液到每孔中。采用酶標(biāo)儀在450 nm檢測(cè)吸光度值（A450 nm）。建立以PD-L1抗體水平為橫坐標(biāo)，A450 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣本中可溶性程序性死亡配體-1（sPD-L1）水平。

1.2.5 隨訪所有受試對(duì)象 采用電話詢問、門診隨診等方式進(jìn)行隨訪。隨訪截止時(shí)間為2017年5月1日，中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月；隨訪主要詢問患者并發(fā)癥、生活狀況、術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)及5年內(nèi)的生存情況等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以M（95%CI）表示，PD-L1的表達(dá)與Ⅰ期肺腺癌病理特征關(guān)系使用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，利用Kaplan-Meier生存曲線分析sPD-L1的表達(dá)對(duì)術(shù)后療效的預(yù)測(cè)，采用Long-rank test分析曲線的差異，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)Ⅰ期肺腺癌術(shù)后預(yù)后行多因素回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sPD-L1表達(dá)與Ⅰ期肺腺癌患者臨床病理特征關(guān)系比較

術(shù)后sPD-L1表達(dá)水平在有胸膜受累者，低分化、病理分期Ⅰb期高于無臨床癥狀、胸膜受累者、中高分化、病理分期Ⅰa期。經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.897、11.116、9.264 及 8.667，P=0.031、0.000、0.003及0.003）；術(shù)后不同ECOG評(píng)分、病理類型及GGO狀態(tài)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.026、12.403 及 10.147，P=0.003、0.000 及 0.001）。不同病理類型間sPD-L1表達(dá)也有差異（F=12.403，P=0.000）。見表 1。

表1 sPD-L1表達(dá)與Ⅰ期肺腺癌患者臨床病理特征關(guān)系比較 （μg/L，±s）

表1 sPD-L1表達(dá)與Ⅰ期肺腺癌患者臨床病理特征關(guān)系比較 （μg/L，±s）

變量 例數(shù) sPD-L1水平 F /t值 P值性別男54 0.84±0.07 0.049 0.815女32 0.82±0.08年齡≥60歲 49 0.83±0.08 0.104 0.764＜60歲 37 0.80±0.09臨床癥狀有25 0.93±0.08 4.897 0.031無61 0.80±0.08胸膜受累有28 1.08±0.08 11.116 0.000無58 0.70±0.10家族史有17 0.83±0.08 0.037 0.863無69 0.82±0.08吸煙無21 0.80±0.08≤400支/年 39 0.85±0.08 0.413 0.497＞400支 /年 26 0.89±0.07術(shù)后ECOG評(píng)分0 33 0.55±0.07 1 26 0.70±0.07 9.026 0.003 2 27 0.99±0.09變量 例數(shù) sPD-L1水平 F /t值 P值腫瘤直徑＜2.0 cm 44 0.83±0.09 1.193 0.117 2.0～3.0 cm 42 0.86±0.09病理分期Ⅰa 49 0.67±0.08 8.667 0.003Ⅰb 37 0.97±0.09分化程度低分化 31 0.97±0.09 9.264 0.003中高分化 55 0.66±0.08病理類型鱗屑樣為主型 21 0.92±0.08腺泡樣為主型 28 0.81±0.08乳頭狀為主型 18 0.88±0.07實(shí)性為主型 8 0.61±0.06微乳頭狀為主型 11 0.42±0.06術(shù)后輔助治療是48 0.721±0.073 12.403 0.000 7.993 0.009否38 0.926±0.082 GGO狀態(tài)純GGO 33 0.57±0.06混合GGO 38 0.79±0.07 10.147 0.001純實(shí)性成分 15 0.98±0.09

2.2 ROC曲線分析sPD-L1表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

通過繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，sPD-L1對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值：敏感性為0.786，特異性為0.809，曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.730（95%CI：0.671，0.876）。當(dāng) Yuden指數(shù)最大時(shí)，sPD-L1診斷術(shù)后復(fù)發(fā)的臨界值為0.650 μg/L。sPD-L1對(duì)術(shù)后生存的預(yù)測(cè)價(jià)值：敏感性為0.799，特異 性 為 0.837，AUC=0.771（95%CI：0.685，0.907）。當(dāng)Yuden指數(shù)最大時(shí)，sPD-L1診斷術(shù)后生存的臨界值為0.672 μg/L。見圖1。

2.3 sPD-L1表達(dá)與Ⅰ期肺腺癌患者術(shù)后5年復(fù)發(fā)的關(guān)系研究

通過繪制ROC曲線，確定術(shù)后5年復(fù)發(fā)的sPD-L1表達(dá)最佳臨界值為0.650 μg/L，并進(jìn)行分組。結(jié)果顯示，sPD-L1高表達(dá)組（＞0.650 μg/L）術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)組（≤0.650 μg/L），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），平均復(fù)發(fā)時(shí)間短于低表達(dá)組（≤ 0.650 μg/L）（P＜0.05）。見表 2。

2.4 總生存率的單因素分析

單因素分析顯示，胸膜受累、術(shù)后ECOG評(píng)分、分化程度、臨床分期、病理類型、GGO狀態(tài)及sPD-L1表達(dá)為患者3、5年生存的影響因素（P＜0.05）。見表3。

2.5 Cox模型多因素分析

以術(shù)后患者生存與否為自變量（0為死亡，1為生存），以5年生存率單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義因素為因變量行Cox模型分析。結(jié)果顯示，ECOG評(píng)分、PD-L1、分化程度、臨床分期、GGO狀態(tài)及胸膜受累為術(shù)后預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。見表4和圖2。

圖1 ROC曲線對(duì)術(shù)后肺腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

表2 不同sPD-L1表達(dá)量術(shù)后5年復(fù)發(fā)率及復(fù)發(fā)時(shí)間的比較

3 討論

肺癌組織學(xué)類型有腺癌、鱗癌、支氣管肺泡癌、小細(xì)胞肺癌及大細(xì)胞肺癌等，其中肺腺癌是肺癌最常見的組織學(xué)類型。早期NSCLC患者多以手術(shù)治療，目前治療NSCLC的手術(shù)方式為肺葉切除術(shù)、亞肺葉切除術(shù)等。有報(bào)道指出[3]，解剖型肺段切除聯(lián)合系統(tǒng)性的淋巴結(jié)清掃被認(rèn)為是治療心肺功能差的早期NSCLC患者的最佳治療選擇，尤其是Ⅰa期NSCLC患者。需要指出的是，對(duì)于肺段切除術(shù)患者，國內(nèi)外均認(rèn)為需要符合以下指征：腫瘤直徑≤2 cm的周圍型肺癌，且至少滿足以下1條特例：即CT掃描顯示GGO成分≥50，影像學(xué)診斷明確結(jié)節(jié)倍增時(shí)間≥400 d；鼓勵(lì)性轉(zhuǎn)移瘤或者良性病變[4]。本研究主要采用肺葉切除術(shù)治療，其也是目前治療肺癌的最無爭議的手術(shù)治療方案。

表3 總生存率的單因素分析

表3 總生存率的單因素分析

表4 Cox模型多因素分析

圖2 Kaplan-Meier法分析不同臨床因素對(duì)術(shù)后生存的影響

臨床研究發(fā)現(xiàn)[5]，Ⅰ期NSCLC患者術(shù)后有30%～40%的患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。本研究顯示，入選的86例患者中有32例出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為37.21%，基本符合以往的研究報(bào)道。有研究顯示[6]，Ⅰa期與Ⅰb期NSCLC患者術(shù)后5年生存率分別為73%、54%，表明臨床分期對(duì)于患者術(shù)后生存有重要影響，也說明肺癌患者越早發(fā)現(xiàn)預(yù)后越好，提示定期體檢對(duì)健康的重要性。Ⅰa期5年內(nèi)生存率高于Ⅰb期，該結(jié)論與劉洋等研究報(bào)道基本一致[7]，其認(rèn)為Ⅰb期患者可能存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，建議患者采用肺葉切除術(shù)治療。本研究發(fā)現(xiàn)采用肺葉切除術(shù)患者預(yù)后仍然較差，表明Ⅰb期患者深層浸潤或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高于Ⅰa期。

GGO對(duì)于早期肺腺癌具有一定的提示作用。研究發(fā)現(xiàn)[8]，肺腺癌表現(xiàn)為GGO具有良好的預(yù)后，這類患者多數(shù)病理特征表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞侵襲性較弱，但混合性GGO或純實(shí)性結(jié)節(jié)更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究采用單因素分析發(fā)現(xiàn)[9]，混合性GGO或純實(shí)性結(jié)節(jié)與患者術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，但多因素分析未證實(shí)到這一作用。本研究通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，GGO狀態(tài)與患者預(yù)后有相關(guān)性。筆者認(rèn)為混合性GGO患者或純實(shí)性結(jié)節(jié)患者易導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者術(shù)后更易復(fù)發(fā)，術(shù)后預(yù)后不良。

2011年，ISALC/ATS/ERS提出肺腺癌新的國際多學(xué)科分類，提出原位肺腺癌和微浸潤性腺癌。其中對(duì)浸潤性肺腺癌又分為6個(gè)亞型，鱗屑樣為主型的肺腺癌患者5年的生存率近100%，而微乳頭型和實(shí)性為主型的肺腺癌患者預(yù)后較差[10]。通過本研究，筆者也發(fā)現(xiàn)微乳頭型和實(shí)性為主型的肺腺癌術(shù)后生存率低于鱗屑樣為主型的患者，這與以往的研究報(bào)道基本一致。

sPD-L1的表達(dá)與I期肺腺癌患者胸膜受累、臨床分期、病理類型及GGO狀態(tài)及術(shù)后ECOG評(píng)分等存在相關(guān)性。TOPALIAN[11]等人研究認(rèn)為，PD-L1在Ⅰ期肺癌中陽性表達(dá)的患者客觀緩解率為36%，陰性表達(dá)組的緩解率為0%，這與筆者研究結(jié)果較為一致。而VELCHETI等[12]人研究結(jié)果，PD-L1高表達(dá)的患者總生存時(shí)間更久，與患者的臨床病理特征如年齡、性別及組織類型等無關(guān)。這與筆者的研究結(jié)果部分一致。YANG等[13]的研究提示PD-L1在Ⅰ期肺腺癌患者中的高表達(dá)可使患者具有更長的無復(fù)發(fā)生存時(shí)間。大部分研究認(rèn)為，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)均提示疾病預(yù)后不佳[14]。本研究采用單因素以及Cox模型比例分析顯示，sPD-L1高表達(dá)為Ⅰ期肺腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素，目前國內(nèi)外有較多學(xué)者均已經(jīng)證實(shí)PD-L1與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，sPD-L1高表達(dá)為Ⅰ期肺腺癌患者經(jīng)電視胸腔鏡肺葉切除聯(lián)合系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素。