姚童翔，原翔，劉怡文，夏金，張耀文，李劍，周福有

[1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng)471003；3.河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院（安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院）胸外科，河南 安陽(yáng) 455000]

食管癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，中國(guó)疾病控制與預(yù)防中心數(shù)據(jù)顯示，食管癌在我國(guó)的每年發(fā)病人數(shù)約為22萬(wàn)人以上，死亡人數(shù)每年則高達(dá)19+萬(wàn)人[1]。食管 鱗 癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是亞洲食管癌的主要病理類型，約占食管癌的90%以上[2]，河南省林州市及其毗鄰的輝縣，安陽(yáng)等地是我國(guó)，也是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)[3]。大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，5年生存率極低[4]。腫瘤免疫抑制在促進(jìn)腫瘤發(fā)展的同時(shí)減弱抗腫瘤治療的療效[5]，程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1, PD-L1）是一個(gè)主要的調(diào)控免疫抑制的分子，PD-L1屬于B7超家族，主要在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、炎癥反應(yīng)細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[6]，與程序性死亡-1（programmed cell death-1, PD1）結(jié)合后可以提供抑制性信號(hào)，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫殺傷[7]，PD-L1高表達(dá)于各種實(shí)體惡性腫瘤，并且可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡[8]，抗PD1/PD-L1通路的藥物在在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等領(lǐng)域取得很大的成功[9]，本研究將分析PD-L1在50例食管鱗癌患者中表達(dá)特征和其臨床意義及預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般研究

選取2014年1月-2014年6月于河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院（安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院）接受手術(shù)治療的食管癌患者，50例食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距腫瘤切緣＞5 cm）標(biāo)本，全部患者均經(jīng)病理學(xué)確診為食管鱗癌。男31例、女19例；年齡42～79歲，平均（61.3±8.3）歲；高分化+中分化40例、低分化10例；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）食管癌第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期8例、Ⅱ期29例、Ⅲ期13例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例。所有患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。該項(xiàng)目通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)PD-L1

采用免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）SP超敏試劑盒（中杉金橋產(chǎn)品編號(hào)SP-9000）檢測(cè)食管癌及其相應(yīng)癌旁組織中PD-L1（抗兔單克隆抗體1∶200，Abcam）的表達(dá)。由2位副高職稱以上的病理醫(yī)師雙盲閱片，隨機(jī)挑選5個(gè)高倍鏡視野觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度（0，陰性；1，弱陽(yáng)性；2，中度陽(yáng)性；3，強(qiáng)陽(yáng)性）和陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)（0，＜5%；1，5%～25%；2，25%～75%；3，≥75%）乘積對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行免疫評(píng)分：0為陰性；1～12為陽(yáng)性，5個(gè)視野免疫評(píng)分均值為最終結(jié)果。

1.3 Western blot檢測(cè)PD-L1

提取組織蛋白后，用BCA法進(jìn)行蛋白定量（康為）。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行上層膠恒壓90 V/30 min，下層膠恒壓120 V/60 min電泳，切膠后采用“三明治夾心法”，恒壓90 V/150 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，TBST清洗1次，30 s/次，加入PD-L1兔一抗（1∶1 000，Abcam）和內(nèi)參GAPDH（1∶2 000康為）4℃過(guò)夜，TBST清洗3次，5 min/次，加入兔二抗（1∶2 000，康為）室溫孵育2 h，再用TBST漂洗3次，5 min/次，ECL（美國(guó)invitrogen公司）處理PVDF膜后用凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）檢測(cè)目的蛋白條帶，Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行定量分析。

1.4 隨訪

50例食管鱗癌患者術(shù)后隨訪時(shí)間30個(gè)月。生存時(shí)間定義為手術(shù)日期至最后一次隨訪日期或死亡，未刪失數(shù)據(jù)為由食管癌導(dǎo)致的死亡患者，刪失數(shù)據(jù)為隨訪至30個(gè)月仍存活患者。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)進(jìn)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier繪制生存曲線并以Log-rank檢驗(yàn)生存時(shí)間之間差異，單因素分析應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，多因素Cox回歸計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比例（hazard ratios, HR）及其95%CI，分析各因素對(duì)食管鱗癌預(yù)后的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌與癌旁組織中PD-L1蛋白的表達(dá)情況

PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)為胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，部分胞漿也有表達(dá)。部分食管鱗癌及癌旁組織中可見PD-L1陽(yáng)性表達(dá)。食管鱗癌組織組與相應(yīng)癌旁組織組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.848，P=0.006），食管鱗癌組織中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率高于相應(yīng)癌旁組織組，且隨著分化程度的降低，PD-L1免疫組化評(píng)分逐漸升高。見表1和圖1。

表1 組織樣本中PD-L1蛋白表達(dá)

圖1 食管鱗癌中PD-L1的表達(dá) （IHC×400）

2.2 食管癌與癌旁組織中PD-L1蛋白的表達(dá)

PD-L1蛋白的分子量約為33 kD。應(yīng)用Image lab軟件將灰度值進(jìn)行定量分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，食管鱗癌組織組與相應(yīng)癌旁組織組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.612，P=0.000），食管鱗癌組織組PD-L1蛋白表達(dá)（灰度均值為4.086±1.060）高于相應(yīng)癌旁組織組（灰度均值為1.884±0.642）。見圖2。

2.3 PD-L1蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性

PD-L1蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度及臨床分期相關(guān)。見表2。

2.4 PD-L1蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌患者預(yù)后

50例食管鱗癌患者術(shù)后30個(gè)月的總生存率為66%；PD-L1陽(yáng)性表達(dá)組30個(gè)月生存率（38.1%）低于陰性組（86.2%）（χ2=14.311，P=0.000）。見圖 3。

圖2 食管鱗癌及相應(yīng)癌旁組織中PD-L1蛋白表達(dá)

表2 PD-L1蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性例（%）

分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及PD-L1蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者生存預(yù)后相關(guān)（見表3）。多變量Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PD-L1表達(dá)是食管鱗癌患者生存的預(yù)后因素。見表4。

表3 食管鱗癌患者預(yù)后Log-rank檢驗(yàn)

表4 食管鱗癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

圖3 食管鱗癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）被認(rèn)為是機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞[10]，臨床研究表明，TIL在腫瘤（包括食管癌）中發(fā)揮關(guān)鍵作用并具有預(yù)后意義[11]。由于腫瘤組織不表達(dá)或極少量表達(dá)MHCⅡ類分子，因此認(rèn)為抗腫瘤特異性免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要為CD8+T細(xì)胞，腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞均高表達(dá)PD1，同時(shí)許多腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1分子[12]，PD-L1與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表達(dá)的PD1結(jié)合后，可導(dǎo)致PD1胞質(zhì)區(qū)的免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序（ITSM）結(jié)構(gòu)域磷酸化，導(dǎo)致下游信號(hào)受到抑制，阻斷Akt和PI3K的活性，干擾IL-2的分泌，減弱TCR/CD28信號(hào)對(duì)免疫細(xì)胞的活化作用[13]，最終抑制T淋巴細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫。除了能直接抑制TIL的功能外，PD-L1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫，研究[14]表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg是具免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群，通過(guò)細(xì)胞分泌白介素10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等免疫負(fù)性細(xì)胞因子抑制免疫應(yīng)答。PD-L1可促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3-T向CD4+CD25+Foxp3+Treg轉(zhuǎn)化[15]，使用單克隆抗體阻斷PD-L1，可減少Treg產(chǎn)生，并且Treg凋亡加速。GENG等[16]發(fā)現(xiàn)，PD-L1能有效促進(jìn)Treg分泌白介素10，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。本研究均表明PD-L1在腫瘤免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征，也是影響腫瘤患者預(yù)后的主要因素。上皮細(xì)胞間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間緊密連接及黏附連接消失，變成了具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能的細(xì)胞，Ⅲ型EMT與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]，人體90%以上惡性腫瘤是上皮性腫瘤，由于EMT是上皮細(xì)胞獲得遷移能力的有效途徑，因此EMT成為癌癥浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要途徑之一。CAO等[18]在小鼠皮膚腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，PD-L1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Slug和Twist的表達(dá)，抑制上皮性鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生，同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了PD-L1的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)EMT的發(fā)生。cop9信號(hào)小體5（cop9 signalosome 5,CNS5）是CNS的重要組成部分，能增強(qiáng)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[19]，LIM等[20]通過(guò)構(gòu)建乳腺癌模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子（TNF-α）通過(guò)活化p65，促進(jìn)CSN5表達(dá)，CSN5和PD-L1結(jié)合后，可使PD-L1去泛素化，增強(qiáng)PD-L1穩(wěn)定性。本研究表明PD-L1在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用。

本研究表明，PD-L1在食管癌組織的表達(dá)高于其相應(yīng)癌旁組織，這與CHEN[4]、OHIGASHIO[21]研究結(jié)果一致。CHEN[22]通過(guò)免疫組化檢測(cè)PD-L1在食管癌細(xì)胞的表達(dá)情況，顯示PD-L1主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)，部分細(xì)胞核也有表達(dá)，但本組資料僅檢測(cè)到PD-L1在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)。本研究顯示，PD-L1的表達(dá)水平與食管癌患者性別、年齡、分化程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，而與浸潤(rùn)范圍、TNM分期相關(guān)。PD-L1高表達(dá)患者比低表達(dá)患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，Cox回歸分析結(jié)果顯示PDL是食管癌獨(dú)立預(yù)后因素，與CHEN[22]、LOOS等[23]結(jié)果一致。

PD-L1在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為食管鱗癌預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。PD1/PD-L1通路的激活可導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，而阻斷PD1/PDL信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)[24]。因此，探討PD-L1與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，進(jìn)一步研究PD-L1在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，使之成為食管鱗癌治療的新靶點(diǎn)，為食管癌開辟新的治療途徑。