李冰,熊正方,郭亞民
(青海省人民醫(yī)院 普外科,青海 西寧 810000)
胃腸間質瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃腸道常見的間質惡性腫瘤,手術切除結合伊馬替尼化療是目前較理想的治療方案[1]。但在化療后期,GIST患者對伊馬替尼敏感性的逐步降低,最終導致患者生存周期縮短[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼HOX轉錄反義RNA(long chain noncoding HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)不僅在腫瘤細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用,還通過內源性競爭微小RNA(MicroRNAs, miRNA)控腫瘤細胞的化療耐藥[3]。本研究以GIST-T1細胞為研究對象,探討HOTAIR是否可通過miRNAs對細胞的化療敏感性發(fā)揮調控作用。
伊馬替尼購自上海21CEC PX藥業(yè)公司,胃腸間質瘤細胞GIST-T1由西安交通大學基礎醫(yī)學院實驗室饋贈。10例胃腸間質瘤組織及配對正常組織由青海省人民醫(yī)院普外科手術提供,并通過醫(yī)院倫理委員會論證;培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)及胎牛血清購自上海酶遠生物科技有限公司,HOTAIR(743-752)野生型、突變型質粒、si-HOTAIR及熒光素酶質粒由上海和元生物公司合成,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司,miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-21、miRNA-218、miRNA-332及miRNA-518引物購自上海和元生物公司,細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)、TdT末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購自南京凱基生物有限公司。
1.2.1 細胞培養(yǎng)及小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)si-下調HOTAIR表達 胃腸間質瘤細胞GIST-T1用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置5%二氧化碳CO2,37℃孵箱中常規(guī)傳代培養(yǎng),選擇對數(shù)生長期的細胞用于后期實驗。將合成的si-HOTAIR(5'-GAACGGGAGUACAGAGAGA-3') 用 LipofectamineTM3000轉染,48 h后換液,用于qRT-PCR檢測。
1.2.2 半 抑 制 濃 度(half maximal inhibitory concentration, IC50)測定 細胞經(jīng)伊馬替尼處理后,按70%~80%濃度比例鋪于96孔板,待細胞完全貼壁后,每孔加入CCK-8試劑10 μl,放入細胞培養(yǎng)箱孵育3 h,分別在24、48、72及96 h用酶標儀檢測A450 nm處光密度值(OD值)。每組至少重復檢查3次。按伊馬替尼藥物濃度的細胞存活率,作對數(shù)曲線,用SPSS軟件計算細胞50%生存率時的藥物濃度IC50。
1.2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 細胞經(jīng)伊馬替尼處理后,采用4%多聚甲醛固定,PBS清洗3次,室溫下依次進行通透,末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)反應液反應、熒光標記試劑作用、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色,在熒光顯微鏡下觀察,隨機選擇8個視野下統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。
1.2.4 熒光素酶活性強度檢測 采用LipofectamineTM3000陽離子脂質體法對GIST-T1細胞進行轉染。將 質 粒 lncRNA-3'-UTR 野 生 型(wild type,wt)、lncRNA-3'-UTR突變型(mutant type,mut)、陰性對照(negative control, NC)轉染至GIST-T1細胞。并歸為相應組別。lncRNA-3'UTR野生型序列(743-752)為5'-UUGGUGUUC-3';lncRNA-3'-UTR突變型序列(743-752)為5'-GGGUCCCGG-3'。共轉染miRNA-21 minics、inhibitor或miRNA-NC;細胞裂解后上機檢測熒光素酶活性強度。原則上,參考Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910熒光酶活性檢測說明書完成,適當做調整。將螢火蟲熒光素酶的熒光值進行歸一化(海腎熒光素酶熒光值),每組實驗重復3次,取平均值進行后續(xù)統(tǒng)計分析。
1.2.5 qRT-PCR檢 測lncRNA HOTAIR和miRNAs水平含量 選擇U6為內參。HOTAIR引物:正向AGCCAGAGGAGGGAAGAGAG,反向TCCCGTTC CCTAGATTTTCC。miRNA-21、miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-218、miRNA-332、miRNA-518和U6引物由上海合元公司合成。miRNA-21引物,正向CGGGATCCAGCCACTACCAAGGCATGT T, 反 向 CGGAATTCAACCACGACTAGAGGCTGAC;miRNA-133引物,正向UUUGGUCCCCUUCAACCAG CUA,反向GCUGGUUGAAGGGGACCAAAUU;miRNA-137引物,正向GCGUUAUUGCUUAAGAAUAC,反向CAGTGCAGGGTCCGAGGT;miRNA-185引物,正向GTGATGAGATGGGCACTGTC,反向TCCTCTGCATTGA TCACCAT;miRNA-218引物正向ACAGCAGGCACA GACAGGCAGU,反向UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUU U;miRNA-332引物,正向GGGTCTTTGGTTATCTAG C,反向TGCGTGTCGTGGAGTC;miRNA-518引物,正向GGCTTCAGATGGACACACGA,反向GCTCTCCGC TCTAATGGCTT;U6引物,正向CTCGCTTCGGCAGC ACA,反向 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗或重復測量設計的方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
GIST組織與正常組織中的lncRNA HOTAIR含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.091,P=0.042),GIST組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達含量高于正常組織(見圖 1)。
si-HOTAIR組與si-NC組細胞中的HOTAIR表達含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=14.315,P=0.007),si-HOTAIR組細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達含量低于si-NC組細胞(見圖2)。
TUNEL結果顯示,si-HOTAIR組細胞DNA損傷陽性細胞比例為(21.4±4.3)%,si-NC組(10.5±1.6)%。兩組DNA損傷陽性細胞比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.384,P=0.037)。si-NC組與si-HOTAIR組吸光度值比較采用重復測量設計的方差分析,結果:①不同時間點間的OD值有差異(F=169.564,P=0.000);②組間OD值有差異(F=69.861,P=0.000),si-HOTAIR組與si-NC組比較,OD值較低,提示HOTAIR干擾后,細胞增殖降低。③兩組的OD指標變化趨勢有差異(F=16.297,P=0.000),見表1。根據(jù)OD值計算各組對于IC50值。si-HOTAIR組細胞伊馬替尼IC50為(14.8±2.6)μmol/L,si-NC組伊馬替尼IC50為(26.7±2.4)μmol/L,兩組比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.716,P=0.032),si-HOTAIR組細胞對伊馬替尼的敏感性高于si-NC組(見圖3)。
圖1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的相對表達量
圖2 LncRNA HOTAIR的相對表達量
表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時間點OD值比較 (±s)
表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時間點OD值比較 (±s)
組別 24 h 48 h 72 h 96 h si-NC 組 0.132±0.004 0.184±0.006 0.647±0.065 1.144±0.072 si-HOTAIR 組 0.134±0.003 0.166±0.005 0.436±0.048 0.867±0.049
圖3 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響
si-HOTAIR組與si-NC組細胞miRNA-21表達含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.714,P=0.008),si-HOTAIR組細胞miRNA-21表達含量高于si-NC對照組(見圖4A)。RNA hybird分析顯示,HOTAIR序列中743-752區(qū)域與miRNA-21核心區(qū)域堿基互補(見圖4B)。熒光素酶報告顯示,在轉染wt-3'-UTRHOTAIR的GIST-T1細胞中,miRNA-21組與miRNANC組進行熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.192,P=0.041);inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組進行熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.672,P=0.008);在轉染 mut-3'-UTR-HOTAIR的GIST-T1細胞中,將miRNA-21組與miRNA-NC組、inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組分別進行熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),HOTAIR與miRNA-21存在序列結合的關系(見圖4C)。
圖4 HOTAIR與miRNA-21的相互關系
TUNEL法結果顯示,miRNA-21+NC組DNA損傷陽性細胞比例為(18.7±2.5)%,miRNA-21+HOTAIR-wt(野生型)組為(8.7±1.4)%,miRNA-21+HOTAIR-mut(突變型)組為(17.2±2.6)%,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.354,P=0.034)。經(jīng)LSD-t檢驗兩兩比較,miR-21+NC和miRNA-21+HOTAIR-mut組TUNEL陽性細胞比例高于miRNA-21+HOTAIR-wt組(t=7.214和 8.133,P=0.024和0.018),miR-21+NC組與 miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.307,P>0.05)。3組吸光度值比較采用重復測量設計的方差分析,結果:①不同時間點間的OD值有差異(F=203.973,P=0.000)。②3組間的OD值有差異(F=54.027,P=0.000),miRNA-21+HOTAIR-wt組 與 miRNA-21+HOT-mut組 比 較,OD值較高,提示HOTAIR突變后,細胞增殖程度較低。③miRNA-21+HOTAIR-wt組與miRNA-21+HOT-mut組的OD指標變化趨勢有差異(F=10.705,P=0.000),見表2。根據(jù)OD值計算各組對于IC50值。IC50結果顯示:miRNA-21+NC組細胞(17.6±2.2)μmol/L,miRNA-21+HOTAIR-wt(野生型)組細胞為(27.3±3.1)μmol/L,miRNA-21+HOTAIR-mut(突變型)組細胞為(18.1±2.9)μmol/L,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=9.268,P=0.017)。經(jīng)LSD-t檢驗兩兩比較,miRNA-21+NC組和miRNA-21+HOTAIR-mut組IC50低于miRNA-21+HOTAIR-wt組(均P<0.05),miRNA-21+NC 組與miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HOTAIR可通過競爭性結合 miRNA-21,降低GIST-T1細胞對伊馬替尼化療敏感性。見圖5。
表2 3組細胞在不同時間點OD值比較 (±s)
表2 3組細胞在不同時間點OD值比較 (±s)
組別 24 h 48 h 72 h 96 h miRNA-21+NC 組 0.137±0.003 0.658±0.016 0.901±0.069 1.471±0.086 miRNA-21+HOT-wt組 0.169±0.004 0.733±0.035 1.059±0.072 1.927±0.089 miRNA-21+HOT-mut組 0.158±0.003 0.591±0.015 0.872±0.051 1.508±0.076
圖5 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響
國內外大量研究發(fā)現(xiàn),lncRNA HOTAIR在肺癌、胃癌及乳腺癌的化療耐藥中發(fā)揮重要作用。如Deng等在肺腺癌中發(fā)現(xiàn),HOTAIR通過調控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子,導致細胞周期停滯,介導順鉑耐藥[4]。有學者通過調查大樣本的臨床數(shù)據(jù),指出HOTAIR可能是順鉑耐藥性卵巢癌的潛在治療靶點[5]。本研究所收集的GIST樣本中,HOTAIR的表達含量高于配對的正常組織。結合細胞水平的研究結果顯示:lncRNA HOTAIR在GIST耐藥細胞中表達含量高于敏感細胞系[6];提示HOTAIR可能在GIST的化療中,起抑制藥物敏感性的作用。
此外,近年來研究表明,lncRNA HOTAIR還在多個消化系統(tǒng)腫瘤的預后分析中發(fā)揮重要作用。如HOTAIR的過度表達與肝癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌的復發(fā)密切相關,并提示腫瘤轉移和預后不良[7]。SMEKALOVA等在小鼠的肝癌模型中,對HOTAIR進行抑制后,肝癌細胞增殖速率降低,對化療藥物的敏感性增高[8]。本研究中,HOTAIR干擾后,GIST細胞對伊馬替尼的敏感性增高,提示HOTAIR可能參與GIST的伊馬替尼化療耐藥。
在作用機制的研究中發(fā)現(xiàn),目前國內外專家一致認為lncRNAs可以在轉錄水平、轉錄后水平、染色質重構3個層面發(fā)揮調控作用,并表現(xiàn)出一定的時間和空間性。Protoso等認為lncRNAs可通過募集特異的染色質或內源競爭RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)機制,誘導表觀遺傳學的調控。如lncRNAs Xist/RepA可通過募集多梳家族蛋白(polycomb-group proteins, PRC2)與果蠅zeste基因增強子同源物2相互作用后,提高其在X染色體的密度,抑制X染色體的活性[9]。還有學者發(fā)現(xiàn),肝癌細胞中,lncRNAUCA1通過結合miR-216b,進一步激活細胞外調節(jié)蛋白 激 酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信號通路,導致腫瘤細胞的惡性增殖[10]。HOTAIR調控轉錄的重要機制之一就是分子誘餌(molecular decoys)。LncRNAs HOTAIR作為ceRNA,與miRNAs小分子的核心序列結合,通過與編碼基因競爭性結合miRNAs,降低后者對下游靶基因的抑制作用。如國內有學者在胃癌細胞中,HOTAIR通過吸附miR-331,調控人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)的活性,進而改變細胞的惡性生物學行為[11]。
本研究中,熒光素酶實驗證實miRNA-21可通過對HOTAIR部分序列結合,降低熒光素酶的相對活性;同時還發(fā)現(xiàn),對相應結合序列進行突變后,熒光素酶的活性未見明顯改變,結合前期基因序列分析結果,提示lncRNA的部分序列與miRNA-21序列存在互補,在GIST-T1細胞中,HOTAIR可通過ceRNA機制結合miRNA-21,從而發(fā)揮相應的作用。將lncRNA HOTAIR與miRNA-21共同轉染GIST-T1細胞后發(fā)現(xiàn),突變型的HOTAIR未能影響GIST-T1細胞在伊馬替尼刺激下的凋亡速度,而野生型的HOTAIR可與miRNA-21核心序列結合,降低TUNEL陽性細胞比例。提示HOTAIR可通過ceRNA機制,調控miR-21活性,進一步降低GIST-T1細胞對伊馬替尼的敏感性。
此外,國內外多數(shù)學者認為,ceRNA機制中,lncRNAs與miRNAs并非完全的一一對應關系。如lncRNA MALAT1可以通過抑制miRNA-146b、miRNA-143和miRNA-124的活性,調控多個腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[12-13];而lncRNA CASC2與lncRNA CRNDE均可與miR-181a的核心序列區(qū)結合,分別調控膠質瘤及結腸癌對化療藥物的耐藥性[14]。在本研究中,敲減HOTAIR 后發(fā)現(xiàn),除miRNA-21外,miRNA-137、miRNA-332和miRNA-218同樣出現(xiàn)變化,提示HOTAIR可能有多個調控基因,有待后期進一步探索。同時應注意到,HOTAIR調控腫瘤細胞的化療耐藥并非完全依賴于miRNAs。如在小細胞肺癌中,HOTAIR可通過影響同源框A1基因的甲基化水平,降低細胞對多柔比星、順鉑和依托泊苷等化療藥物的敏感性;或通過作用于某信號傳導通路,直接作用于腫瘤凋亡相關蛋白,改變DNA損傷修復及細胞周期進程等發(fā)揮作用[15]。
本研究的不足之處在于僅驗證HOTAIR是否通過ceRNA機制調控GIST對伊馬替尼的敏感性。后續(xù)可通過耐藥基因的甲基化、細胞周期蛋白的調控或細胞自噬等方面進行深入研究。此外,本研究的細胞系較為單一,組織樣本數(shù)量較少,后續(xù)將在多個GIST細胞系及動物模型水平進行驗證。總之,HOTAIR可通過抑制miRNA-21的活性,影響GIST對伊馬替尼的敏感性,有望為GIST的化療提供新的實驗依據(jù)。