亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        長鏈非編碼RNA HOTAIR對胃腸間質瘤細胞化療敏感性的影響

        2018-10-11 03:12:48李冰熊正方郭亞民
        中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2018年27期
        關鍵詞:伊馬替尼熒光素酶敏感性

        李冰,熊正方,郭亞民

        (青海省人民醫(yī)院 普外科,青海 西寧 810000)

        胃腸間質瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃腸道常見的間質惡性腫瘤,手術切除結合伊馬替尼化療是目前較理想的治療方案[1]。但在化療后期,GIST患者對伊馬替尼敏感性的逐步降低,最終導致患者生存周期縮短[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼HOX轉錄反義RNA(long chain noncoding HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)不僅在腫瘤細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用,還通過內源性競爭微小RNA(MicroRNAs, miRNA)控腫瘤細胞的化療耐藥[3]。本研究以GIST-T1細胞為研究對象,探討HOTAIR是否可通過miRNAs對細胞的化療敏感性發(fā)揮調控作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        伊馬替尼購自上海21CEC PX藥業(yè)公司,胃腸間質瘤細胞GIST-T1由西安交通大學基礎醫(yī)學院實驗室饋贈。10例胃腸間質瘤組織及配對正常組織由青海省人民醫(yī)院普外科手術提供,并通過醫(yī)院倫理委員會論證;培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)及胎牛血清購自上海酶遠生物科技有限公司,HOTAIR(743-752)野生型、突變型質粒、si-HOTAIR及熒光素酶質粒由上海和元生物公司合成,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司,miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-21、miRNA-218、miRNA-332及miRNA-518引物購自上海和元生物公司,細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)、TdT末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購自南京凱基生物有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng)及小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)si-下調HOTAIR表達 胃腸間質瘤細胞GIST-T1用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置5%二氧化碳CO2,37℃孵箱中常規(guī)傳代培養(yǎng),選擇對數(shù)生長期的細胞用于后期實驗。將合成的si-HOTAIR(5'-GAACGGGAGUACAGAGAGA-3') 用 LipofectamineTM3000轉染,48 h后換液,用于qRT-PCR檢測。

        1.2.2 半 抑 制 濃 度(half maximal inhibitory concentration, IC50)測定 細胞經(jīng)伊馬替尼處理后,按70%~80%濃度比例鋪于96孔板,待細胞完全貼壁后,每孔加入CCK-8試劑10 μl,放入細胞培養(yǎng)箱孵育3 h,分別在24、48、72及96 h用酶標儀檢測A450 nm處光密度值(OD值)。每組至少重復檢查3次。按伊馬替尼藥物濃度的細胞存活率,作對數(shù)曲線,用SPSS軟件計算細胞50%生存率時的藥物濃度IC50。

        1.2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 細胞經(jīng)伊馬替尼處理后,采用4%多聚甲醛固定,PBS清洗3次,室溫下依次進行通透,末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)反應液反應、熒光標記試劑作用、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色,在熒光顯微鏡下觀察,隨機選擇8個視野下統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

        1.2.4 熒光素酶活性強度檢測 采用LipofectamineTM3000陽離子脂質體法對GIST-T1細胞進行轉染。將 質 粒 lncRNA-3'-UTR 野 生 型(wild type,wt)、lncRNA-3'-UTR突變型(mutant type,mut)、陰性對照(negative control, NC)轉染至GIST-T1細胞。并歸為相應組別。lncRNA-3'UTR野生型序列(743-752)為5'-UUGGUGUUC-3';lncRNA-3'-UTR突變型序列(743-752)為5'-GGGUCCCGG-3'。共轉染miRNA-21 minics、inhibitor或miRNA-NC;細胞裂解后上機檢測熒光素酶活性強度。原則上,參考Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910熒光酶活性檢測說明書完成,適當做調整。將螢火蟲熒光素酶的熒光值進行歸一化(海腎熒光素酶熒光值),每組實驗重復3次,取平均值進行后續(xù)統(tǒng)計分析。

        1.2.5 qRT-PCR檢 測lncRNA HOTAIR和miRNAs水平含量 選擇U6為內參。HOTAIR引物:正向AGCCAGAGGAGGGAAGAGAG,反向TCCCGTTC CCTAGATTTTCC。miRNA-21、miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-218、miRNA-332、miRNA-518和U6引物由上海合元公司合成。miRNA-21引物,正向CGGGATCCAGCCACTACCAAGGCATGT T, 反 向 CGGAATTCAACCACGACTAGAGGCTGAC;miRNA-133引物,正向UUUGGUCCCCUUCAACCAG CUA,反向GCUGGUUGAAGGGGACCAAAUU;miRNA-137引物,正向GCGUUAUUGCUUAAGAAUAC,反向CAGTGCAGGGTCCGAGGT;miRNA-185引物,正向GTGATGAGATGGGCACTGTC,反向TCCTCTGCATTGA TCACCAT;miRNA-218引物正向ACAGCAGGCACA GACAGGCAGU,反向UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUU U;miRNA-332引物,正向GGGTCTTTGGTTATCTAG C,反向TGCGTGTCGTGGAGTC;miRNA-518引物,正向GGCTTCAGATGGACACACGA,反向GCTCTCCGC TCTAATGGCTT;U6引物,正向CTCGCTTCGGCAGC ACA,反向 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗或重復測量設計的方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的表達水平

        GIST組織與正常組織中的lncRNA HOTAIR含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.091,P=0.042),GIST組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達含量高于正常組織(見圖 1)。

        2.2 GIST-T1細胞si-HOTAIR的干擾效果

        si-HOTAIR組與si-NC組細胞中的HOTAIR表達含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=14.315,P=0.007),si-HOTAIR組細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達含量低于si-NC組細胞(見圖2)。

        2.3 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        TUNEL結果顯示,si-HOTAIR組細胞DNA損傷陽性細胞比例為(21.4±4.3)%,si-NC組(10.5±1.6)%。兩組DNA損傷陽性細胞比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.384,P=0.037)。si-NC組與si-HOTAIR組吸光度值比較采用重復測量設計的方差分析,結果:①不同時間點間的OD值有差異(F=169.564,P=0.000);②組間OD值有差異(F=69.861,P=0.000),si-HOTAIR組與si-NC組比較,OD值較低,提示HOTAIR干擾后,細胞增殖降低。③兩組的OD指標變化趨勢有差異(F=16.297,P=0.000),見表1。根據(jù)OD值計算各組對于IC50值。si-HOTAIR組細胞伊馬替尼IC50為(14.8±2.6)μmol/L,si-NC組伊馬替尼IC50為(26.7±2.4)μmol/L,兩組比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.716,P=0.032),si-HOTAIR組細胞對伊馬替尼的敏感性高于si-NC組(見圖3)。

        2.4 HOTAIR與miRNA-21的相互關系

        圖1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的相對表達量

        圖2 LncRNA HOTAIR的相對表達量

        表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時間點OD值比較 (±s)

        表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時間點OD值比較 (±s)

        組別 24 h 48 h 72 h 96 h si-NC 組 0.132±0.004 0.184±0.006 0.647±0.065 1.144±0.072 si-HOTAIR 組 0.134±0.003 0.166±0.005 0.436±0.048 0.867±0.049

        圖3 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        si-HOTAIR組與si-NC組細胞miRNA-21表達含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.714,P=0.008),si-HOTAIR組細胞miRNA-21表達含量高于si-NC對照組(見圖4A)。RNA hybird分析顯示,HOTAIR序列中743-752區(qū)域與miRNA-21核心區(qū)域堿基互補(見圖4B)。熒光素酶報告顯示,在轉染wt-3'-UTRHOTAIR的GIST-T1細胞中,miRNA-21組與miRNANC組進行熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.192,P=0.041);inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組進行熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.672,P=0.008);在轉染 mut-3'-UTR-HOTAIR的GIST-T1細胞中,將miRNA-21組與miRNA-NC組、inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組分別進行熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),HOTAIR與miRNA-21存在序列結合的關系(見圖4C)。

        圖4 HOTAIR與miRNA-21的相互關系

        2.5 HOTAIR競爭性結合miRNA-21對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        TUNEL法結果顯示,miRNA-21+NC組DNA損傷陽性細胞比例為(18.7±2.5)%,miRNA-21+HOTAIR-wt(野生型)組為(8.7±1.4)%,miRNA-21+HOTAIR-mut(突變型)組為(17.2±2.6)%,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.354,P=0.034)。經(jīng)LSD-t檢驗兩兩比較,miR-21+NC和miRNA-21+HOTAIR-mut組TUNEL陽性細胞比例高于miRNA-21+HOTAIR-wt組(t=7.214和 8.133,P=0.024和0.018),miR-21+NC組與 miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.307,P>0.05)。3組吸光度值比較采用重復測量設計的方差分析,結果:①不同時間點間的OD值有差異(F=203.973,P=0.000)。②3組間的OD值有差異(F=54.027,P=0.000),miRNA-21+HOTAIR-wt組 與 miRNA-21+HOT-mut組 比 較,OD值較高,提示HOTAIR突變后,細胞增殖程度較低。③miRNA-21+HOTAIR-wt組與miRNA-21+HOT-mut組的OD指標變化趨勢有差異(F=10.705,P=0.000),見表2。根據(jù)OD值計算各組對于IC50值。IC50結果顯示:miRNA-21+NC組細胞(17.6±2.2)μmol/L,miRNA-21+HOTAIR-wt(野生型)組細胞為(27.3±3.1)μmol/L,miRNA-21+HOTAIR-mut(突變型)組細胞為(18.1±2.9)μmol/L,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=9.268,P=0.017)。經(jīng)LSD-t檢驗兩兩比較,miRNA-21+NC組和miRNA-21+HOTAIR-mut組IC50低于miRNA-21+HOTAIR-wt組(均P<0.05),miRNA-21+NC 組與miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HOTAIR可通過競爭性結合 miRNA-21,降低GIST-T1細胞對伊馬替尼化療敏感性。見圖5。

        表2 3組細胞在不同時間點OD值比較 (±s)

        表2 3組細胞在不同時間點OD值比較 (±s)

        組別 24 h 48 h 72 h 96 h miRNA-21+NC 組 0.137±0.003 0.658±0.016 0.901±0.069 1.471±0.086 miRNA-21+HOT-wt組 0.169±0.004 0.733±0.035 1.059±0.072 1.927±0.089 miRNA-21+HOT-mut組 0.158±0.003 0.591±0.015 0.872±0.051 1.508±0.076

        圖5 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        3 討論

        國內外大量研究發(fā)現(xiàn),lncRNA HOTAIR在肺癌、胃癌及乳腺癌的化療耐藥中發(fā)揮重要作用。如Deng等在肺腺癌中發(fā)現(xiàn),HOTAIR通過調控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子,導致細胞周期停滯,介導順鉑耐藥[4]。有學者通過調查大樣本的臨床數(shù)據(jù),指出HOTAIR可能是順鉑耐藥性卵巢癌的潛在治療靶點[5]。本研究所收集的GIST樣本中,HOTAIR的表達含量高于配對的正常組織。結合細胞水平的研究結果顯示:lncRNA HOTAIR在GIST耐藥細胞中表達含量高于敏感細胞系[6];提示HOTAIR可能在GIST的化療中,起抑制藥物敏感性的作用。

        此外,近年來研究表明,lncRNA HOTAIR還在多個消化系統(tǒng)腫瘤的預后分析中發(fā)揮重要作用。如HOTAIR的過度表達與肝癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌的復發(fā)密切相關,并提示腫瘤轉移和預后不良[7]。SMEKALOVA等在小鼠的肝癌模型中,對HOTAIR進行抑制后,肝癌細胞增殖速率降低,對化療藥物的敏感性增高[8]。本研究中,HOTAIR干擾后,GIST細胞對伊馬替尼的敏感性增高,提示HOTAIR可能參與GIST的伊馬替尼化療耐藥。

        在作用機制的研究中發(fā)現(xiàn),目前國內外專家一致認為lncRNAs可以在轉錄水平、轉錄后水平、染色質重構3個層面發(fā)揮調控作用,并表現(xiàn)出一定的時間和空間性。Protoso等認為lncRNAs可通過募集特異的染色質或內源競爭RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)機制,誘導表觀遺傳學的調控。如lncRNAs Xist/RepA可通過募集多梳家族蛋白(polycomb-group proteins, PRC2)與果蠅zeste基因增強子同源物2相互作用后,提高其在X染色體的密度,抑制X染色體的活性[9]。還有學者發(fā)現(xiàn),肝癌細胞中,lncRNAUCA1通過結合miR-216b,進一步激活細胞外調節(jié)蛋白 激 酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信號通路,導致腫瘤細胞的惡性增殖[10]。HOTAIR調控轉錄的重要機制之一就是分子誘餌(molecular decoys)。LncRNAs HOTAIR作為ceRNA,與miRNAs小分子的核心序列結合,通過與編碼基因競爭性結合miRNAs,降低后者對下游靶基因的抑制作用。如國內有學者在胃癌細胞中,HOTAIR通過吸附miR-331,調控人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)的活性,進而改變細胞的惡性生物學行為[11]。

        本研究中,熒光素酶實驗證實miRNA-21可通過對HOTAIR部分序列結合,降低熒光素酶的相對活性;同時還發(fā)現(xiàn),對相應結合序列進行突變后,熒光素酶的活性未見明顯改變,結合前期基因序列分析結果,提示lncRNA的部分序列與miRNA-21序列存在互補,在GIST-T1細胞中,HOTAIR可通過ceRNA機制結合miRNA-21,從而發(fā)揮相應的作用。將lncRNA HOTAIR與miRNA-21共同轉染GIST-T1細胞后發(fā)現(xiàn),突變型的HOTAIR未能影響GIST-T1細胞在伊馬替尼刺激下的凋亡速度,而野生型的HOTAIR可與miRNA-21核心序列結合,降低TUNEL陽性細胞比例。提示HOTAIR可通過ceRNA機制,調控miR-21活性,進一步降低GIST-T1細胞對伊馬替尼的敏感性。

        此外,國內外多數(shù)學者認為,ceRNA機制中,lncRNAs與miRNAs并非完全的一一對應關系。如lncRNA MALAT1可以通過抑制miRNA-146b、miRNA-143和miRNA-124的活性,調控多個腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[12-13];而lncRNA CASC2與lncRNA CRNDE均可與miR-181a的核心序列區(qū)結合,分別調控膠質瘤及結腸癌對化療藥物的耐藥性[14]。在本研究中,敲減HOTAIR 后發(fā)現(xiàn),除miRNA-21外,miRNA-137、miRNA-332和miRNA-218同樣出現(xiàn)變化,提示HOTAIR可能有多個調控基因,有待后期進一步探索。同時應注意到,HOTAIR調控腫瘤細胞的化療耐藥并非完全依賴于miRNAs。如在小細胞肺癌中,HOTAIR可通過影響同源框A1基因的甲基化水平,降低細胞對多柔比星、順鉑和依托泊苷等化療藥物的敏感性;或通過作用于某信號傳導通路,直接作用于腫瘤凋亡相關蛋白,改變DNA損傷修復及細胞周期進程等發(fā)揮作用[15]。

        本研究的不足之處在于僅驗證HOTAIR是否通過ceRNA機制調控GIST對伊馬替尼的敏感性。后續(xù)可通過耐藥基因的甲基化、細胞周期蛋白的調控或細胞自噬等方面進行深入研究。此外,本研究的細胞系較為單一,組織樣本數(shù)量較少,后續(xù)將在多個GIST細胞系及動物模型水平進行驗證。總之,HOTAIR可通過抑制miRNA-21的活性,影響GIST對伊馬替尼的敏感性,有望為GIST的化療提供新的實驗依據(jù)。

        猜你喜歡
        伊馬替尼熒光素酶敏感性
        NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構建及其與SND1靶向關系的驗證
        不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關miRNAs靶向基因TIAM1的影響
        重組雙熒光素酶報告基因質粒psiCHECK-2-Intron構建轉染及轉染細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達
        釔對Mg-Zn-Y-Zr合金熱裂敏感性影響
        AH70DB鋼焊接熱影響區(qū)組織及其冷裂敏感性
        焊接(2016年1期)2016-02-27 12:55:37
        如何培養(yǎng)和提高新聞敏感性
        新聞傳播(2015年8期)2015-07-18 11:08:24
        慢性粒細胞白血病患者發(fā)生伊馬替尼耐藥病例1例并文獻復習
        甲磺酸伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的臨床效果及其對免疫功能的影響
        人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構建與鑒定及活性檢測
        微小RNA與食管癌放射敏感性的相關研究
        亚洲欧洲无码一区二区三区| 国产成人av综合色| 一二三四视频社区在线| 亚洲精品黄网在线观看| 国产黄色看三级三级三级| 亚洲国产一区二区三区| 免费国产黄网站在线观看可以下载 | 中文字幕精品一区二区精品| 麻豆亚洲av永久无码精品久久| 国产又黄又爽又无遮挡的视频| 风间由美中文字幕在线| 中文区中文字幕免费看| 欧美亚洲日本国产综合在线| 精品亚洲女同一区二区| 午夜桃色视频在线观看 | 欧美寡妇xxxx黑人猛交| 在线免费观看韩国a视频| 久久国产亚洲av高清色| 人妻少妇哀求别拔出来| 国产97在线 | 中文| 2021国产精品一区二区在线| 中文字幕亚洲乱码熟女1区2区 | 一区二区人妻乳中文字幕| 国产夫妇肉麻对白| 久久久久99精品国产片| 开心五月婷婷综合网站| 极品av一区二区三区| 国产精品成人观看视频| 2021年最新久久久视精品爱| 偷窥偷拍一区二区三区| 欧洲多毛裸体xxxxx| 色狠狠色狠狠综合一区| av天堂手机在线免费| 亚洲国产av自拍一区| 日韩精品无码视频一区二区蜜桃 | 亚洲中字慕日产2020| 日韩在线看片| 美女被躁到高潮嗷嗷免费观看| 成品人视频ww入口| 呻吟国产av久久一区二区| 61精品人妻一区二区三区蜜桃|