李冰，熊正方，郭亞民

（青海省人民醫(yī)院 普外科，青海 西寧 810000）

胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumor, GIST）是胃腸道常見的間質惡性腫瘤，手術切除結合伊馬替尼化療是目前較理想的治療方案[1]。但在化療后期，GIST患者對伊馬替尼敏感性的逐步降低，最終導致患者生存周期縮短[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼HOX轉錄反義RNA（long chain noncoding HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）不僅在腫瘤細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，還通過內源性競爭微小RNA（MicroRNAs, miRNA）控腫瘤細胞的化療耐藥[3]。本研究以GIST-T1細胞為研究對象，探討HOTAIR是否可通過miRNAs對細胞的化療敏感性發(fā)揮調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

伊馬替尼購自上海21CEC PX藥業(yè)公司，胃腸間質瘤細胞GIST-T1由西安交通大學基礎醫(yī)學院實驗室饋贈。10例胃腸間質瘤組織及配對正常組織由青海省人民醫(yī)院普外科手術提供，并通過醫(yī)院倫理委員會論證；培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium, DMEM）及胎牛血清購自上海酶遠生物科技有限公司，HOTAIR（743-752）野生型、突變型質粒、si-HOTAIR及熒光素酶質粒由上海和元生物公司合成，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司，miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-21、miRNA-218、miRNA-332及miRNA-518引物購自上海和元生物公司，細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8, CCK-8）、TdT末端標記（TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）試劑盒購自南京凱基生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及小干擾RNA（Small interfering RNA,siRNA）si-下調HOTAIR表達 胃腸間質瘤細胞GIST-T1用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置5%二氧化碳CO2，37℃孵箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細胞用于后期實驗。將合成的si-HOTAIR（5'-GAACGGGAGUACAGAGAGA-3'） 用 LipofectamineTM3000轉染，48 h后換液，用于qRT-PCR檢測。

1.2.2 半 抑 制 濃 度（half maximal inhibitory concentration, IC50）測定 細胞經(jīng)伊馬替尼處理后，按70%～80%濃度比例鋪于96孔板，待細胞完全貼壁后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，放入細胞培養(yǎng)箱孵育3 h，分別在24、48、72及96 h用酶標儀檢測A450 nm處光密度值（OD值）。每組至少重復檢查3次。按伊馬替尼藥物濃度的細胞存活率，作對數(shù)曲線，用SPSS軟件計算細胞50%生存率時的藥物濃度IC50。

1.2.3 TUNEL檢測細胞凋亡 細胞經(jīng)伊馬替尼處理后，采用4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次，室溫下依次進行通透，末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）反應液反應、熒光標記試劑作用、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色，在熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇8個視野下統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

1.2.4 熒光素酶活性強度檢測 采用LipofectamineTM3000陽離子脂質體法對GIST-T1細胞進行轉染。將 質 粒 lncRNA-3'-UTR 野 生 型（wild type，wt）、lncRNA-3'-UTR突變型（mutant type，mut）、陰性對照（negative control, NC）轉染至GIST-T1細胞。并歸為相應組別。lncRNA-3'UTR野生型序列（743-752）為5'-UUGGUGUUC-3'；lncRNA-3'-UTR突變型序列（743-752）為5'-GGGUCCCGG-3'。共轉染miRNA-21 minics、inhibitor或miRNA-NC；細胞裂解后上機檢測熒光素酶活性強度。原則上，參考Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910熒光酶活性檢測說明書完成，適當做調整。將螢火蟲熒光素酶的熒光值進行歸一化（海腎熒光素酶熒光值），每組實驗重復3次，取平均值進行后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.2.5 qRT-PCR檢 測lncRNA HOTAIR和miRNAs水平含量 選擇U6為內參。HOTAIR引物：正向AGCCAGAGGAGGGAAGAGAG，反向TCCCGTTC CCTAGATTTTCC。miRNA-21、miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-218、miRNA-332、miRNA-518和U6引物由上海合元公司合成。miRNA-21引物，正向CGGGATCCAGCCACTACCAAGGCATGT T， 反 向 CGGAATTCAACCACGACTAGAGGCTGAC；miRNA-133引物，正向UUUGGUCCCCUUCAACCAG CUA，反向GCUGGUUGAAGGGGACCAAAUU；miRNA-137引物，正向GCGUUAUUGCUUAAGAAUAC，反向CAGTGCAGGGTCCGAGGT；miRNA-185引物，正向GTGATGAGATGGGCACTGTC，反向TCCTCTGCATTGA TCACCAT；miRNA-218引物正向ACAGCAGGCACA GACAGGCAGU，反向UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUU U；miRNA-332引物，正向GGGTCTTTGGTTATCTAG C，反向TGCGTGTCGTGGAGTC；miRNA-518引物，正向GGCTTCAGATGGACACACGA，反向GCTCTCCGC TCTAATGGCTT；U6引物，正向CTCGCTTCGGCAGC ACA，反向 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的表達水平

GIST組織與正常組織中的lncRNA HOTAIR含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.091，P=0.042），GIST組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達含量高于正常組織（見圖 1）。

2.2 GIST-T1細胞si-HOTAIR的干擾效果

si-HOTAIR組與si-NC組細胞中的HOTAIR表達含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.315，P=0.007），si-HOTAIR組細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達含量低于si-NC組細胞（見圖2）。

2.3 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

TUNEL結果顯示，si-HOTAIR組細胞DNA損傷陽性細胞比例為（21.4±4.3）%，si-NC組（10.5±1.6）%。兩組DNA損傷陽性細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.384，P=0.037）。si-NC組與si-HOTAIR組吸光度值比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD值有差異（F=169.564，P=0.000）；②組間OD值有差異（F=69.861，P=0.000），si-HOTAIR組與si-NC組比較，OD值較低，提示HOTAIR干擾后，細胞增殖降低。③兩組的OD指標變化趨勢有差異（F=16.297，P=0.000），見表1。根據(jù)OD值計算各組對于IC50值。si-HOTAIR組細胞伊馬替尼IC50為（14.8±2.6）μmol/L，si-NC組伊馬替尼IC50為（26.7±2.4）μmol/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.716，P=0.032），si-HOTAIR組細胞對伊馬替尼的敏感性高于si-NC組（見圖3）。

2.4 HOTAIR與miRNA-21的相互關系

圖1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的相對表達量

圖2 LncRNA HOTAIR的相對表達量

表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時間點OD值比較 （±s）

表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時間點OD值比較 （±s）

組別 24 h 48 h 72 h 96 h si-NC 組 0.132±0.004 0.184±0.006 0.647±0.065 1.144±0.072 si-HOTAIR 組 0.134±0.003 0.166±0.005 0.436±0.048 0.867±0.049

圖3 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

si-HOTAIR組與si-NC組細胞miRNA-21表達含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.714，P=0.008），si-HOTAIR組細胞miRNA-21表達含量高于si-NC對照組（見圖4A）。RNA hybird分析顯示，HOTAIR序列中743-752區(qū)域與miRNA-21核心區(qū)域堿基互補（見圖4B）。熒光素酶報告顯示，在轉染wt-3'-UTRHOTAIR的GIST-T1細胞中，miRNA-21組與miRNANC組進行熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.192，P=0.041）；inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組進行熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.672，P=0.008）；在轉染 mut-3'-UTR-HOTAIR的GIST-T1細胞中，將miRNA-21組與miRNA-NC組、inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組分別進行熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），HOTAIR與miRNA-21存在序列結合的關系（見圖4C）。

圖4 HOTAIR與miRNA-21的相互關系

2.5 HOTAIR競爭性結合miRNA-21對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

TUNEL法結果顯示，miRNA-21+NC組DNA損傷陽性細胞比例為（18.7±2.5）%，miRNA-21+HOTAIR-wt（野生型）組為（8.7±1.4）%，miRNA-21+HOTAIR-mut（突變型）組為（17.2±2.6）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.354，P=0.034）。經(jīng)LSD-t檢驗兩兩比較，miR-21+NC和miRNA-21+HOTAIR-mut組TUNEL陽性細胞比例高于miRNA-21+HOTAIR-wt組（t=7.214和 8.133，P=0.024和0.018），miR-21+NC組與 miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.307，P＞0.05）。3組吸光度值比較采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD值有差異（F=203.973，P=0.000）。②3組間的OD值有差異（F=54.027，P=0.000），miRNA-21+HOTAIR-wt組 與 miRNA-21+HOT-mut組 比 較，OD值較高，提示HOTAIR突變后，細胞增殖程度較低。③miRNA-21+HOTAIR-wt組與miRNA-21+HOT-mut組的OD指標變化趨勢有差異（F=10.705，P=0.000），見表2。根據(jù)OD值計算各組對于IC50值。IC50結果顯示：miRNA-21+NC組細胞（17.6±2.2）μmol/L，miRNA-21+HOTAIR-wt（野生型）組細胞為（27.3±3.1）μmol/L，miRNA-21+HOTAIR-mut（突變型）組細胞為（18.1±2.9）μmol/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.268，P=0.017）。經(jīng)LSD-t檢驗兩兩比較，miRNA-21+NC組和miRNA-21+HOTAIR-mut組IC50低于miRNA-21+HOTAIR-wt組（均P＜0.05），miRNA-21+NC 組與miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。HOTAIR可通過競爭性結合 miRNA-21，降低GIST-T1細胞對伊馬替尼化療敏感性。見圖5。

表2 3組細胞在不同時間點OD值比較 （±s）

表2 3組細胞在不同時間點OD值比較 （±s）

組別 24 h 48 h 72 h 96 h miRNA-21+NC 組 0.137±0.003 0.658±0.016 0.901±0.069 1.471±0.086 miRNA-21+HOT-wt組 0.169±0.004 0.733±0.035 1.059±0.072 1.927±0.089 miRNA-21+HOT-mut組 0.158±0.003 0.591±0.015 0.872±0.051 1.508±0.076

圖5 HOTAIR對GIST-T1細胞伊馬替尼化療敏感性的影響

3 討論

國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR在肺癌、胃癌及乳腺癌的化療耐藥中發(fā)揮重要作用。如Deng等在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)，HOTAIR通過調控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，導致細胞周期停滯，介導順鉑耐藥[4]。有學者通過調查大樣本的臨床數(shù)據(jù)，指出HOTAIR可能是順鉑耐藥性卵巢癌的潛在治療靶點[5]。本研究所收集的GIST樣本中，HOTAIR的表達含量高于配對的正常組織。結合細胞水平的研究結果顯示：lncRNA HOTAIR在GIST耐藥細胞中表達含量高于敏感細胞系[6]；提示HOTAIR可能在GIST的化療中，起抑制藥物敏感性的作用。

此外，近年來研究表明，lncRNA HOTAIR還在多個消化系統(tǒng)腫瘤的預后分析中發(fā)揮重要作用。如HOTAIR的過度表達與肝癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌的復發(fā)密切相關，并提示腫瘤轉移和預后不良[7]。SMEKALOVA等在小鼠的肝癌模型中，對HOTAIR進行抑制后，肝癌細胞增殖速率降低，對化療藥物的敏感性增高[8]。本研究中，HOTAIR干擾后，GIST細胞對伊馬替尼的敏感性增高，提示HOTAIR可能參與GIST的伊馬替尼化療耐藥。

在作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)，目前國內外專家一致認為lncRNAs可以在轉錄水平、轉錄后水平、染色質重構3個層面發(fā)揮調控作用，并表現(xiàn)出一定的時間和空間性。Protoso等認為lncRNAs可通過募集特異的染色質或內源競爭RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）機制，誘導表觀遺傳學的調控。如lncRNAs Xist/RepA可通過募集多梳家族蛋白（polycomb-group proteins, PRC2）與果蠅zeste基因增強子同源物2相互作用后，提高其在X染色體的密度，抑制X染色體的活性[9]。還有學者發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中，lncRNAUCA1通過結合miR-216b，進一步激活細胞外調節(jié)蛋白 激 酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）信號通路，導致腫瘤細胞的惡性增殖[10]。HOTAIR調控轉錄的重要機制之一就是分子誘餌（molecular decoys）。LncRNAs HOTAIR作為ceRNA，與miRNAs小分子的核心序列結合，通過與編碼基因競爭性結合miRNAs，降低后者對下游靶基因的抑制作用。如國內有學者在胃癌細胞中，HOTAIR通過吸附miR-331，調控人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）的活性，進而改變細胞的惡性生物學行為[11]。

本研究中，熒光素酶實驗證實miRNA-21可通過對HOTAIR部分序列結合，降低熒光素酶的相對活性；同時還發(fā)現(xiàn)，對相應結合序列進行突變后，熒光素酶的活性未見明顯改變，結合前期基因序列分析結果，提示lncRNA的部分序列與miRNA-21序列存在互補，在GIST-T1細胞中，HOTAIR可通過ceRNA機制結合miRNA-21，從而發(fā)揮相應的作用。將lncRNA HOTAIR與miRNA-21共同轉染GIST-T1細胞后發(fā)現(xiàn)，突變型的HOTAIR未能影響GIST-T1細胞在伊馬替尼刺激下的凋亡速度，而野生型的HOTAIR可與miRNA-21核心序列結合，降低TUNEL陽性細胞比例。提示HOTAIR可通過ceRNA機制，調控miR-21活性，進一步降低GIST-T1細胞對伊馬替尼的敏感性。

此外，國內外多數(shù)學者認為，ceRNA機制中，lncRNAs與miRNAs并非完全的一一對應關系。如lncRNA MALAT1可以通過抑制miRNA-146b、miRNA-143和miRNA-124的活性，調控多個腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[12-13]；而lncRNA CASC2與lncRNA CRNDE均可與miR-181a的核心序列區(qū)結合，分別調控膠質瘤及結腸癌對化療藥物的耐藥性[14]。在本研究中，敲減HOTAIR 后發(fā)現(xiàn)，除miRNA-21外，miRNA-137、miRNA-332和miRNA-218同樣出現(xiàn)變化，提示HOTAIR可能有多個調控基因，有待后期進一步探索。同時應注意到，HOTAIR調控腫瘤細胞的化療耐藥并非完全依賴于miRNAs。如在小細胞肺癌中，HOTAIR可通過影響同源框A1基因的甲基化水平，降低細胞對多柔比星、順鉑和依托泊苷等化療藥物的敏感性；或通過作用于某信號傳導通路，直接作用于腫瘤凋亡相關蛋白，改變DNA損傷修復及細胞周期進程等發(fā)揮作用[15]。

本研究的不足之處在于僅驗證HOTAIR是否通過ceRNA機制調控GIST對伊馬替尼的敏感性。后續(xù)可通過耐藥基因的甲基化、細胞周期蛋白的調控或細胞自噬等方面進行深入研究。此外，本研究的細胞系較為單一，組織樣本數(shù)量較少，后續(xù)將在多個GIST細胞系及動物模型水平進行驗證。總之，HOTAIR可通過抑制miRNA-21的活性，影響GIST對伊馬替尼的敏感性，有望為GIST的化療提供新的實驗依據(jù)。