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        長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR對(duì)胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞化療敏感性的影響

        2018-10-11 03:12:48李冰熊正方郭亞民
        關(guān)鍵詞:伊馬替尼熒光素酶敏感性

        李冰,熊正方,郭亞民

        (青海省人民醫(yī)院 普外科,青海 西寧 810000)

        胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃腸道常見的間質(zhì)惡性腫瘤,手術(shù)切除結(jié)合伊馬替尼化療是目前較理想的治療方案[1]。但在化療后期,GIST患者對(duì)伊馬替尼敏感性的逐步降低,最終導(dǎo)致患者生存周期縮短[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)鏈非編碼HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(long chain noncoding HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)不僅在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用,還通過內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)微小RNA(MicroRNAs, miRNA)控腫瘤細(xì)胞的化療耐藥[3]。本研究以GIST-T1細(xì)胞為研究對(duì)象,探討HOTAIR是否可通過miRNAs對(duì)細(xì)胞的化療敏感性發(fā)揮調(diào)控作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        伊馬替尼購(gòu)自上海21CEC PX藥業(yè)公司,胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST-T1由西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。10例胃腸間質(zhì)瘤組織及配對(duì)正常組織由青海省人民醫(yī)院普外科手術(shù)提供,并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)論證;培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)及胎牛血清購(gòu)自上海酶遠(yuǎn)生物科技有限公司,HOTAIR(743-752)野生型、突變型質(zhì)粒、si-HOTAIR及熒光素酶質(zhì)粒由上海和元生物公司合成,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司,miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-21、miRNA-218、miRNA-332及miRNA-518引物購(gòu)自上海和元生物公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)、TdT末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)si-下調(diào)HOTAIR表達(dá) 胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST-T1用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置5%二氧化碳CO2,37℃孵箱中常規(guī)傳代培養(yǎng),選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后期實(shí)驗(yàn)。將合成的si-HOTAIR(5'-GAACGGGAGUACAGAGAGA-3') 用 LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染,48 h后換液,用于qRT-PCR檢測(cè)。

        1.2.2 半 抑 制 濃 度(half maximal inhibitory concentration, IC50)測(cè)定 細(xì)胞經(jīng)伊馬替尼處理后,按70%~80%濃度比例鋪于96孔板,待細(xì)胞完全貼壁后,每孔加入CCK-8試劑10 μl,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h,分別在24、48、72及96 h用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450 nm處光密度值(OD值)。每組至少重復(fù)檢查3次。按伊馬替尼藥物濃度的細(xì)胞存活率,作對(duì)數(shù)曲線,用SPSS軟件計(jì)算細(xì)胞50%生存率時(shí)的藥物濃度IC50。

        1.2.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)伊馬替尼處理后,采用4%多聚甲醛固定,PBS清洗3次,室溫下依次進(jìn)行通透,末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)反應(yīng)液反應(yīng)、熒光標(biāo)記試劑作用、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色,在熒光顯微鏡下觀察,隨機(jī)選擇8個(gè)視野下統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

        1.2.4 熒光素酶活性強(qiáng)度檢測(cè) 采用LipofectamineTM3000陽(yáng)離子脂質(zhì)體法對(duì)GIST-T1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將 質(zhì) 粒 lncRNA-3'-UTR 野 生 型(wild type,wt)、lncRNA-3'-UTR突變型(mutant type,mut)、陰性對(duì)照(negative control, NC)轉(zhuǎn)染至GIST-T1細(xì)胞。并歸為相應(yīng)組別。lncRNA-3'UTR野生型序列(743-752)為5'-UUGGUGUUC-3';lncRNA-3'-UTR突變型序列(743-752)為5'-GGGUCCCGG-3'。共轉(zhuǎn)染miRNA-21 minics、inhibitor或miRNA-NC;細(xì)胞裂解后上機(jī)檢測(cè)熒光素酶活性強(qiáng)度。原則上,參考Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910熒光酶活性檢測(cè)說明書完成,適當(dāng)做調(diào)整。將螢火蟲熒光素酶的熒光值進(jìn)行歸一化(海腎熒光素酶熒光值),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

        1.2.5 qRT-PCR檢 測(cè)lncRNA HOTAIR和miRNAs水平含量 選擇U6為內(nèi)參。HOTAIR引物:正向AGCCAGAGGAGGGAAGAGAG,反向TCCCGTTC CCTAGATTTTCC。miRNA-21、miRNA-133、miRNA-137、miRNA-185、miRNA-218、miRNA-332、miRNA-518和U6引物由上海合元公司合成。miRNA-21引物,正向CGGGATCCAGCCACTACCAAGGCATGT T, 反 向 CGGAATTCAACCACGACTAGAGGCTGAC;miRNA-133引物,正向UUUGGUCCCCUUCAACCAG CUA,反向GCUGGUUGAAGGGGACCAAAUU;miRNA-137引物,正向GCGUUAUUGCUUAAGAAUAC,反向CAGTGCAGGGTCCGAGGT;miRNA-185引物,正向GTGATGAGATGGGCACTGTC,反向TCCTCTGCATTGA TCACCAT;miRNA-218引物正向ACAGCAGGCACA GACAGGCAGU,反向UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUU U;miRNA-332引物,正向GGGTCTTTGGTTATCTAG C,反向TGCGTGTCGTGGAGTC;miRNA-518引物,正向GGCTTCAGATGGACACACGA,反向GCTCTCCGC TCTAATGGCTT;U6引物,正向CTCGCTTCGGCAGC ACA,反向 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的表達(dá)水平

        GIST組織與正常組織中的lncRNA HOTAIR含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.091,P=0.042),GIST組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達(dá)含量高于正常組織(見圖 1)。

        2.2 GIST-T1細(xì)胞si-HOTAIR的干擾效果

        si-HOTAIR組與si-NC組細(xì)胞中的HOTAIR表達(dá)含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.315,P=0.007),si-HOTAIR組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達(dá)含量低于si-NC組細(xì)胞(見圖2)。

        2.3 HOTAIR對(duì)GIST-T1細(xì)胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        TUNEL結(jié)果顯示,si-HOTAIR組細(xì)胞DNA損傷陽(yáng)性細(xì)胞比例為(21.4±4.3)%,si-NC組(10.5±1.6)%。兩組DNA損傷陽(yáng)性細(xì)胞比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.384,P=0.037)。si-NC組與si-HOTAIR組吸光度值比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD值有差異(F=169.564,P=0.000);②組間OD值有差異(F=69.861,P=0.000),si-HOTAIR組與si-NC組比較,OD值較低,提示HOTAIR干擾后,細(xì)胞增殖降低。③兩組的OD指標(biāo)變化趨勢(shì)有差異(F=16.297,P=0.000),見表1。根據(jù)OD值計(jì)算各組對(duì)于IC50值。si-HOTAIR組細(xì)胞伊馬替尼IC50為(14.8±2.6)μmol/L,si-NC組伊馬替尼IC50為(26.7±2.4)μmol/L,兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.716,P=0.032),si-HOTAIR組細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性高于si-NC組(見圖3)。

        2.4 HOTAIR與miRNA-21的相互關(guān)系

        圖1 LncRNA HOTAIR在GIST組織及正常組織中的相對(duì)表達(dá)量

        圖2 LncRNA HOTAIR的相對(duì)表達(dá)量

        表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 (±s)

        表1 si-NC組與si-HOTAIR組在不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 (±s)

        組別 24 h 48 h 72 h 96 h si-NC 組 0.132±0.004 0.184±0.006 0.647±0.065 1.144±0.072 si-HOTAIR 組 0.134±0.003 0.166±0.005 0.436±0.048 0.867±0.049

        圖3 HOTAIR對(duì)GIST-T1細(xì)胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        si-HOTAIR組與si-NC組細(xì)胞miRNA-21表達(dá)含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.714,P=0.008),si-HOTAIR組細(xì)胞miRNA-21表達(dá)含量高于si-NC對(duì)照組(見圖4A)。RNA hybird分析顯示,HOTAIR序列中743-752區(qū)域與miRNA-21核心區(qū)域堿基互補(bǔ)(見圖4B)。熒光素酶報(bào)告顯示,在轉(zhuǎn)染wt-3'-UTRHOTAIR的GIST-T1細(xì)胞中,miRNA-21組與miRNANC組進(jìn)行熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.192,P=0.041);inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組進(jìn)行熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.672,P=0.008);在轉(zhuǎn)染 mut-3'-UTR-HOTAIR的GIST-T1細(xì)胞中,將miRNA-21組與miRNA-NC組、inhibitor-miRNA-21組與inhibitormiRNA-NC組分別進(jìn)行熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HOTAIR與miRNA-21存在序列結(jié)合的關(guān)系(見圖4C)。

        圖4 HOTAIR與miRNA-21的相互關(guān)系

        2.5 HOTAIR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-21對(duì)GIST-T1細(xì)胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        TUNEL法結(jié)果顯示,miRNA-21+NC組DNA損傷陽(yáng)性細(xì)胞比例為(18.7±2.5)%,miRNA-21+HOTAIR-wt(野生型)組為(8.7±1.4)%,miRNA-21+HOTAIR-mut(突變型)組為(17.2±2.6)%,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.354,P=0.034)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較,miR-21+NC和miRNA-21+HOTAIR-mut組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例高于miRNA-21+HOTAIR-wt組(t=7.214和 8.133,P=0.024和0.018),miR-21+NC組與 miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.307,P>0.05)。3組吸光度值比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,結(jié)果:①不同時(shí)間點(diǎn)間的OD值有差異(F=203.973,P=0.000)。②3組間的OD值有差異(F=54.027,P=0.000),miRNA-21+HOTAIR-wt組 與 miRNA-21+HOT-mut組 比 較,OD值較高,提示HOTAIR突變后,細(xì)胞增殖程度較低。③miRNA-21+HOTAIR-wt組與miRNA-21+HOT-mut組的OD指標(biāo)變化趨勢(shì)有差異(F=10.705,P=0.000),見表2。根據(jù)OD值計(jì)算各組對(duì)于IC50值。IC50結(jié)果顯示:miRNA-21+NC組細(xì)胞(17.6±2.2)μmol/L,miRNA-21+HOTAIR-wt(野生型)組細(xì)胞為(27.3±3.1)μmol/L,miRNA-21+HOTAIR-mut(突變型)組細(xì)胞為(18.1±2.9)μmol/L,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.268,P=0.017)。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)兩兩比較,miRNA-21+NC組和miRNA-21+HOTAIR-mut組IC50低于miRNA-21+HOTAIR-wt組(均P<0.05),miRNA-21+NC 組與miRNA-21+HOTAIR-mut組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HOTAIR可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 miRNA-21,降低GIST-T1細(xì)胞對(duì)伊馬替尼化療敏感性。見圖5。

        表2 3組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 (±s)

        表2 3組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 (±s)

        組別 24 h 48 h 72 h 96 h miRNA-21+NC 組 0.137±0.003 0.658±0.016 0.901±0.069 1.471±0.086 miRNA-21+HOT-wt組 0.169±0.004 0.733±0.035 1.059±0.072 1.927±0.089 miRNA-21+HOT-mut組 0.158±0.003 0.591±0.015 0.872±0.051 1.508±0.076

        圖5 HOTAIR對(duì)GIST-T1細(xì)胞伊馬替尼化療敏感性的影響

        3 討論

        國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn),lncRNA HOTAIR在肺癌、胃癌及乳腺癌的化療耐藥中發(fā)揮重要作用。如Deng等在肺腺癌中發(fā)現(xiàn),HOTAIR通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯,介導(dǎo)順鉑耐藥[4]。有學(xué)者通過調(diào)查大樣本的臨床數(shù)據(jù),指出HOTAIR可能是順鉑耐藥性卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)[5]。本研究所收集的GIST樣本中,HOTAIR的表達(dá)含量高于配對(duì)的正常組織。結(jié)合細(xì)胞水平的研究結(jié)果顯示:lncRNA HOTAIR在GIST耐藥細(xì)胞中表達(dá)含量高于敏感細(xì)胞系[6];提示HOTAIR可能在GIST的化療中,起抑制藥物敏感性的作用。

        此外,近年來研究表明,lncRNA HOTAIR還在多個(gè)消化系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后分析中發(fā)揮重要作用。如HOTAIR的過度表達(dá)與肝癌、胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)密切相關(guān),并提示腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良[7]。SMEKALOVA等在小鼠的肝癌模型中,對(duì)HOTAIR進(jìn)行抑制后,肝癌細(xì)胞增殖速率降低,對(duì)化療藥物的敏感性增高[8]。本研究中,HOTAIR干擾后,GIST細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性增高,提示HOTAIR可能參與GIST的伊馬替尼化療耐藥。

        在作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),目前國(guó)內(nèi)外專家一致認(rèn)為lncRNAs可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、染色質(zhì)重構(gòu)3個(gè)層面發(fā)揮調(diào)控作用,并表現(xiàn)出一定的時(shí)間和空間性。Protoso等認(rèn)為lncRNAs可通過募集特異的染色質(zhì)或內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)機(jī)制,誘導(dǎo)表觀遺傳學(xué)的調(diào)控。如lncRNAs Xist/RepA可通過募集多梳家族蛋白(polycomb-group proteins, PRC2)與果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2相互作用后,提高其在X染色體的密度,抑制X染色體的活性[9]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞中,lncRNAUCA1通過結(jié)合miR-216b,進(jìn)一步激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白 激 酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信號(hào)通路,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[10]。HOTAIR調(diào)控轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制之一就是分子誘餌(molecular decoys)。LncRNAs HOTAIR作為ceRNA,與miRNAs小分子的核心序列結(jié)合,通過與編碼基因競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNAs,降低后者對(duì)下游靶基因的抑制作用。如國(guó)內(nèi)有學(xué)者在胃癌細(xì)胞中,HOTAIR通過吸附miR-331,調(diào)控人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)的活性,進(jìn)而改變細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[11]。

        本研究中,熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-21可通過對(duì)HOTAIR部分序列結(jié)合,降低熒光素酶的相對(duì)活性;同時(shí)還發(fā)現(xiàn),對(duì)相應(yīng)結(jié)合序列進(jìn)行突變后,熒光素酶的活性未見明顯改變,結(jié)合前期基因序列分析結(jié)果,提示lncRNA的部分序列與miRNA-21序列存在互補(bǔ),在GIST-T1細(xì)胞中,HOTAIR可通過ceRNA機(jī)制結(jié)合miRNA-21,從而發(fā)揮相應(yīng)的作用。將lncRNA HOTAIR與miRNA-21共同轉(zhuǎn)染GIST-T1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),突變型的HOTAIR未能影響GIST-T1細(xì)胞在伊馬替尼刺激下的凋亡速度,而野生型的HOTAIR可與miRNA-21核心序列結(jié)合,降低TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例。提示HOTAIR可通過ceRNA機(jī)制,調(diào)控miR-21活性,進(jìn)一步降低GIST-T1細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性。

        此外,國(guó)內(nèi)外多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,ceRNA機(jī)制中,lncRNAs與miRNAs并非完全的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。如lncRNA MALAT1可以通過抑制miRNA-146b、miRNA-143和miRNA-124的活性,調(diào)控多個(gè)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[12-13];而lncRNA CASC2與lncRNA CRNDE均可與miR-181a的核心序列區(qū)結(jié)合,分別調(diào)控膠質(zhì)瘤及結(jié)腸癌對(duì)化療藥物的耐藥性[14]。在本研究中,敲減HOTAIR 后發(fā)現(xiàn),除miRNA-21外,miRNA-137、miRNA-332和miRNA-218同樣出現(xiàn)變化,提示HOTAIR可能有多個(gè)調(diào)控基因,有待后期進(jìn)一步探索。同時(shí)應(yīng)注意到,HOTAIR調(diào)控腫瘤細(xì)胞的化療耐藥并非完全依賴于miRNAs。如在小細(xì)胞肺癌中,HOTAIR可通過影響同源框A1基因的甲基化水平,降低細(xì)胞對(duì)多柔比星、順鉑和依托泊苷等化療藥物的敏感性;或通過作用于某信號(hào)傳導(dǎo)通路,直接作用于腫瘤凋亡相關(guān)蛋白,改變DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞周期進(jìn)程等發(fā)揮作用[15]。

        本研究的不足之處在于僅驗(yàn)證HOTAIR是否通過ceRNA機(jī)制調(diào)控GIST對(duì)伊馬替尼的敏感性。后續(xù)可通過耐藥基因的甲基化、細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控或細(xì)胞自噬等方面進(jìn)行深入研究。此外,本研究的細(xì)胞系較為單一,組織樣本數(shù)量較少,后續(xù)將在多個(gè)GIST細(xì)胞系及動(dòng)物模型水平進(jìn)行驗(yàn)證。總之,HOTAIR可通過抑制miRNA-21的活性,影響GIST對(duì)伊馬替尼的敏感性,有望為GIST的化療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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