李 靜，楊 洋，肖 濤，李 韜，歐 瑜，傅曉鐘，劉 亭

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.藥學(xué)院、3. 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；4. 貴陽(yáng)市婦幼保健院藥劑科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

人有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(human organic anion transporter 1, hOAT1)(SLC22A6)屬于可溶性載體家族SLC22。hOAT1于1997年在大鼠、小鼠和冬季牙鲆體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，并在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)后，介導(dǎo)對(duì)氨基馬尿酸(p-aminohippuric acid，PAH)、環(huán)狀核苷酸和其他小有機(jī)陰離子的攝取，表明其具有廣泛的底物特異性[1]，其 cDNA的CDS區(qū)編碼556個(gè)氨基酸殘基，有12個(gè)跨膜區(qū)域。hOAT1 在腎近端小管基底外側(cè)膜高表達(dá)，腦、胎盤(pán)亦有微弱的表達(dá)。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物非常廣泛，包括內(nèi)源性和外源性物質(zhì)[2]。內(nèi)源性底物包括葉酸、前列腺素、環(huán)核苷酸等，外源性底物包括抗生素(先鋒霉素II、青霉素)、多種抗病毒藥物(阿德福韋酯、西多福韋、阿昔洛韋)、多種利尿劑(利尿磺胺、布美他尼)，以及非甾體類(lèi)抗炎藥、甲氨蝶呤、赫曲霉素A等。同時(shí)，研究表明，核苷(核酸)類(lèi)抗病毒藥物進(jìn)入體內(nèi)后，代謝形成的磷酸(膦酸)雙負(fù)離子能被存在于腎小管基底膜上的hOAT1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而沉積于腎臟近曲小管內(nèi)，后者通過(guò)抑制近曲小管上皮細(xì)胞線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的復(fù)制，從而使mtDNA耗碣，并最終降低由mtDNA編碼的細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, COX)水平。破壞上皮細(xì)胞氧化呼吸過(guò)程是藥物產(chǎn)生腎毒性的根本原因[3-4]。

為獲得穩(wěn)定表達(dá)hOAT1的細(xì)胞模型，用于對(duì)抗病毒核苷(核酸)類(lèi)藥物的腎毒性機(jī)制進(jìn)行評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá) hOAT1的細(xì)胞模型，不僅為抗病毒核苷與核酸類(lèi)藥物引起的臨床劑量依賴性腎毒性的機(jī)制研究奠定模型基礎(chǔ)，也為體外研究 hOAT1 底物或抑制劑的篩選提供一個(gè)便利的工具。

1 材料

1.1試劑質(zhì)粒hOAT1 DNA購(gòu)于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS，批號(hào)1227694)、DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)8117288)，均購(gòu)于Gibco公司；TOP10感受態(tài)大腸桿菌、真核表達(dá)載體pEGFP-N1和HEK293細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；丙磺舒(批號(hào)R09O8X45213)、兔抗β-actin單抗(批號(hào)20170310)、G418(批號(hào)712O031)、質(zhì)粒提取試劑盒(批號(hào)10217KA1)、ECL發(fā)光液(批號(hào)20170215)，均購(gòu)于索萊寶公司；對(duì)氨基馬尿酸(批號(hào)wkq17041705)購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(批號(hào)00324407)、NheI(批號(hào)00307817)購(gòu)于Thermo公司；FuGENE? 6 Transfection Reagent(批號(hào)0000285054)購(gòu)于Promega公司； TRIzol? Reagent(批號(hào)152104)購(gòu)于Ambion公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(批號(hào)AK5402)、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(批號(hào)AK7802)、TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購(gòu)于TaKaRa公司；鼠抗EGFP單克隆抗體(批號(hào)GR191827-3)、兔抗hOAT1多克隆抗體(批號(hào)GR176005-10)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2儀器超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；Modle 680酶標(biāo)儀、Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；Acugity-TQD型UPLC-MS/MS (Waters公司)；垂直電泳槽、PowerPac Basic電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoRΙ與NheI將hOAT1基因片段與pEGFP-N1載體分別雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收純化后，將酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物加入至TOP10感受態(tài)細(xì)胞懸液中，輕輕渦旋離心管混勻，冰浴放置30 min。置于42℃水浴1 min，然后快速置于冰浴中3 min。加入LB培養(yǎng)基，180 r·min-1、37℃培養(yǎng)1 h。

將轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物涂布于含卡拉霉素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)的LB瓊脂平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑選單克隆，并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRΙ與NheI將質(zhì)粒雙酶切后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。最終獲得重組質(zhì)粒命名為pEGFP-hOAT1。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中, 于37℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合度, 用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的密度接種于6孔板, 待細(xì)胞長(zhǎng)至85%匯合度時(shí)，為最佳轉(zhuǎn)染狀態(tài)。將FuGENE? 6 Transfection Reagent加入到無(wú)血清培養(yǎng)基中，混合后孵育5 min，分別加入重組質(zhì)粒pEGFP-hOAT1和空白質(zhì)粒pEGFP-N1，混合后孵育15 min。分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞的表達(dá)與分布。

2.3篩選穩(wěn)定表達(dá)[5]pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞 配制合適比例的pEGFP-hOAT1質(zhì)粒DNA與FuGENE? 6 Transfection Reagent的轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染液經(jīng)比例優(yōu)化，確定最佳比例為1 ∶3(μg ∶μL)，將轉(zhuǎn)染液加入至HEK293細(xì)胞中，于37℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察，將轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95%的細(xì)胞原培養(yǎng)液更換為濃度800 mg·L-1的G418選擇性培養(yǎng)液，間隔1 d更換1次含相同濃度的G418培養(yǎng)液，進(jìn)行抗性篩選14 d，挑選單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，更換維持濃度的G418培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4hOAT1mRNA的表達(dá)檢測(cè)

2.4.1RT-PCR檢測(cè)hOAT1 mRNA水平 以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，野生型HEK293細(xì)胞為對(duì)照組，收集細(xì)胞。利用TRIzol? Reagent提取RNA，測(cè)定其濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，利用hOAT1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。GAPDH上游引物5′-GGTCCTGGTTCTCATTCCT-3′，下游引物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；hOAT1上游引物5′-CTTGAAC TACCTGCAGACAG-3′，下游引物5′-GACATAGCCAATCAAGGTGC-3′，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

2.4.2qRT-PCR檢測(cè)hOAT1 mRNA水平 以mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序同“2.4.1”。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-△△Ct方法分析數(shù)據(jù)。

2.5Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平分別收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，及野生型HEK293細(xì)胞，PBS洗滌2次，利用膜蛋白提取試劑盒分別提取膜蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量。取等量膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用1×TBST洗膜3次(每次5 min)。將膜在5%的BSA中封閉2 h，分別加入兔抗β-actin單抗(1 ∶1 000)、兔抗hOAT1多克隆抗體(1 ∶2 500)和鼠抗EGFP單克隆抗體(1 ∶2 500)，4℃孵育過(guò)夜，用1×TBST洗膜3次(每次5 min)。加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h后，用1×TBST洗膜3次(每次5 min)?，F(xiàn)配發(fā)光液，進(jìn)行曝光拍照。

2.6pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的功能鑒定

2.6.1考察PAH細(xì)胞安全濃度范圍 分別將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的野生型HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞用0.25%的消化后，以密度為1.5×108·L-1鋪96孔板。取100 μL細(xì)胞懸浮液于每孔，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組，即加入等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，分別在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中，設(shè)置濃度為25、50、100、200、400 μmol·L-1的PAH組。孵育1 h，棄藥液，每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基及5 μL MTS，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，考察PAH安全濃度范圍。細(xì)胞存活率=OD樣品組/OD對(duì)照組×100%。

2.6.2考察丙磺舒細(xì)胞安全濃度范圍[6]細(xì)胞分組同“2.6.1”。培養(yǎng)24 h，分別給藥在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中，設(shè)置給藥濃度為25、50、100、200、400 μmol·L-1的丙磺舒。孵育1 h，棄藥液，每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基及5 μL MTS，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，按“2.6.1”公式計(jì)算細(xì)胞存活率，考察丙磺舒安全濃度范圍。

2.6.3野生型HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞對(duì)PAH的攝取 將野生型HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行PAH攝取實(shí)驗(yàn)。棄去舊培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液沖洗1次，隨后加入PAH，其稀釋質(zhì)量濃度為10、25、50、100、200 μmol·L-1，空白對(duì)照孔加入等體積HBSS緩沖液，將細(xì)胞放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h。迅速吸棄藥液，加入冰冷PBS反復(fù)洗2次。隨后使用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎細(xì)胞，12 000×g離心20 min。吸取上清液20 μL，BCA法測(cè)定蛋白濃度，另取500 μL上清液氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇混勻，12 000×g離心20 min，沉淀蛋白，重復(fù)2次。最后取上清200 μL，UPLC-MS/MS分析受試化合物的攝取量。

2.6.4丙磺舒對(duì)野生型HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞的抑制作用 將野生型HEK293細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行丙磺舒對(duì)hOAT1抑制實(shí)驗(yàn)。棄去舊培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液沖洗1次，隨后加入丙磺舒，其稀釋質(zhì)量濃度為100 μmol·L-1，空白對(duì)照孔加入等體積HBSS緩沖液，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育10 min。迅速吸棄藥液，加入PAH。細(xì)胞分組與操作同“2.6.3”。

2.7色譜與質(zhì)譜條件色譜柱 Waters Van Guard BEH C l8 (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)柱，柱溫：45℃，流速：0.25 mL·min-1，進(jìn)樣體積：2.0 μL，流動(dòng)相：A：含0.1%甲酸的乙腈，B：含0.1%甲酸的水，梯度洗脫：(0～1.5 min，5% A；1.5～4 min，5%～100% A ；4～6 min，100%～ 5% A )。錐孔電壓為：45 V，質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR)，正離子模式，以葛根素為內(nèi)標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1真核表達(dá)載體pEGFP-hOAT1鑒定Fig 1瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，pEGFP-hOAT1質(zhì)粒的主帶在6.4 kb左右，與理想大小相符合。EcoRΙ與BamHI雙酶切pEGFP-hOAT1質(zhì)粒的產(chǎn)物亦符合理論大小(Fig 2)。將陽(yáng)性克隆測(cè)序，結(jié)果與GenBank(AB009697.1)報(bào)道的hOAT1序列相符，說(shuō)明質(zhì)粒pEGFP-hOAT1構(gòu)建成功。

Fig 1 Gel electrophoresis of pEGFP-hOAT1recombinant plasmid

M: Marker; 1: pEGFP-hOAT1 recombinant plasmid.

Fig 2 Identification of the recombinant plasmiddigested by EcoR Ι and Nhe I

M: Marker; 1: pEGFP-hOAT1 recombinant plasmid.

3.2穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-hOAT1細(xì)胞株的建立與鑒定FuGENE? 6 Transfection Reagent介導(dǎo) pEGFP-hOAT1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞36 h后，在含有G418(800 mg·L-1)的選擇培養(yǎng)基中篩選14 d，4 d后會(huì)有大量的明顯死亡(Fig 3)。獲得穩(wěn)定表達(dá)hOAT1的HEK293細(xì)胞。

Fig 3 Cell morphology(×100)

A: Culture aton the third 3rd day; B: Culture aton the fourteenth 14th day.

3.2.1綠色熒光鑒定 FuGENE? 6 Transfection Reagent介導(dǎo)pEGFP-hOAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞36 h 后，熒光顯微鏡下觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后綠色熒光信號(hào)分布。如Fig 4所示，細(xì)胞融合至80%時(shí)，綠色熒光陽(yáng)性率高達(dá)100% 。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)?？捎行П磉_(dá)帶綠色熒光的pEGFP-hOAT1融合蛋白。

Fig 4 Cell morphology under fluorescence microscope(×100).

3.2.2hOAT1 mRNA在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) Fig 5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在GAPDH表達(dá)量相同時(shí)，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可擴(kuò)增出190 bp的目的片段，而HEK293細(xì)胞組擴(kuò)增不出目的條帶。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中hOAT1 mRNA表達(dá)明顯升高，表達(dá)量為HEK293細(xì)胞的5 600倍，差異具有顯著性(P<0.01)。結(jié)果表明，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞能轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，外源基因已整合到HEK293細(xì)胞基因組。

Fig 5 Analysis of hOAT1 mRNA

3.2.3Western blot鑒定hOAT1、EGFP特異性蛋白的表達(dá) Fig 6的Western blot結(jié)果表明，pEGFP-hOAT1融合蛋白在穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞株高表達(dá)，且分子量大小正確，與RT-PCR結(jié)果一致。說(shuō)明pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。

Fig 6 hOAT1 and EGFP protein were analyzed

1: Stable transfected HEK293 cells; 2: HEK293 cells.

3.3pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞功能鑒定

3.3.1PAH的細(xì)胞安全濃度范圍 如Tab 1所示，PAH濃度在400 μmol·L-1以下，對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞均沒(méi)有毒性作用(P>0.05)。因此，選擇給藥時(shí)間1 h以內(nèi)、給藥濃度400 μmol·L-1以下，考察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞對(duì)PAH的攝取能力。

Tab 1 Toxic effects of PAH on cells after 1

3.3.2丙磺舒的細(xì)胞安全濃度范圍 如Tab 2所示，丙磺舒濃度在400 μmol·L-1以下對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及其野生型細(xì)胞均沒(méi)有毒性作用(P>0.05)。因此，選擇給藥時(shí)間1 h以內(nèi)、給藥濃度400 μmol·L-1以下，考察丙磺舒對(duì)hOAT1的抑制作用。

3.3.3HEK293細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞對(duì)PAH的攝取 分別給予PAH(10、25、50、100、200 μmol·L-1)至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞及野生型HEK293細(xì)胞中，并測(cè)定PAH的攝取量。Fig 7結(jié)果表明，與HEK293細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞對(duì)PAH的攝取量明顯較高(P<0.01)，且在100 μmol·L-1時(shí)，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對(duì)PAH的攝取量趨于飽和。說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系模型構(gòu)建成功。

Tab2Toxiceffectsofprobenecidoncells

GroupConcentration/μmol·L-1Cell activity/%HEK293 cellsStable transfected HEK293 cellsControl-100.00±8.25100.00±7.62Probene-cid25102.42±8.00103.76±1.6950 108.25±5.07105.53±1.04100 105.21±7.45107.81±7.10200 104.64±9.92101.74±4.27400107.49±6.98102.32±3.70

Fig 7 Concentration dependence of PAH uptake

**P<0.01vsHEK293 group

3.3.4丙磺舒對(duì)hOAT1的抑制作用 對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育，給予濃度為100 μmol·L-1的丙磺舒后，吸棄藥液，分別給予PAH(10、25、50、100、200 μmol·L-1)，測(cè)定PAH的攝取量。Fig 8結(jié)果表明，加入丙磺舒后，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對(duì)PAH的攝取量明顯下降(P<0.01)，丙磺舒對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系有明顯抑制作用。丙磺舒為hOAT1的抑制劑，說(shuō)明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系模型構(gòu)建成功。

Fig 8 Probenecid suppressesd concentration

**P<0.01vsstable transfected HEK293 cells with inhibitors

4 討論

外源基因是否表達(dá)，以及目的蛋白是否具有活性，是鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是否構(gòu)建成功的重要標(biāo)志。構(gòu)建 hOAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的意義不僅在于基因水平要有變化，蛋白水平也要有變化，本方法目的是從蛋白水平對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)研究。本文通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞呈綠色熒光；采用PCR和Western blot技術(shù)，檢測(cè)hOAT1和EGFP在基因及蛋白水平均有表達(dá)；并且PAH攝取及進(jìn)一步的丙磺舒抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所表達(dá)的hOAT1目的蛋白具有活性。綜上所述，pEGFP-hOAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系構(gòu)建成功。PAH為hOAT1經(jīng)典底物，故選擇PAH對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞進(jìn)行功能鑒定。為了進(jìn)一步驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞篩選模型的可行性，給予丙磺舒對(duì)模型進(jìn)行了抑制劑研究，結(jié)果表明，對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞系有明顯抑制作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示該細(xì)胞模型可用于hOAT1抑制劑的篩選。

真核表達(dá)載體pEGFP-N1中包含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 (enhanced green fluorescence protein，EGFP)，EGFP是水母體內(nèi)綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的突變體[7]，該蛋白對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有毒性、表達(dá)穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度是GFP的6倍以上；且EGFP與蛋白偶聯(lián)后，不僅可在細(xì)胞內(nèi)觀察目的蛋白表達(dá)、分布，還不會(huì)影響外源蛋白的構(gòu)象和功能。而在目的基因hOAT1中缺少EGFP基因，本文采用將EGFP與hOAT1基因相連接，得到可表達(dá)EGFP-hOAT1的融合蛋白，使其帶有綠色熒光標(biāo)記，易于觀察。FuGENE?6 Transfection Reagent是一種新型的非脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染試劑，需要少量的外源DNA，轉(zhuǎn)染效率高，且該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性良好，不會(huì)對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生直接損傷或毒性。本文構(gòu)建EGFP-hOAT1融合蛋白，利用FuGENE?6 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察不僅可以通過(guò)熒光強(qiáng)弱反映目的蛋白的含量，還可以研究目的蛋白的細(xì)胞分布。且PAH的攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)PAH的攝取量明顯較高，表明EGFP-hOAT1融合蛋白具有hOAT1特性介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。此外，本文發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染效率與宿主細(xì)胞的狀態(tài)有較大的聯(lián)系，一般會(huì)選用50代以下的細(xì)胞，若出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染效率下降，會(huì)轉(zhuǎn)用新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞，且細(xì)胞匯合度在80%時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最佳；在12 h后就可以觀察到熒光信號(hào)，并隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)，在36 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳。

在以往的研究中，hOAT1轉(zhuǎn)染模型的構(gòu)建大多采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染基因?qū)爰?xì)胞得以表達(dá)，但是基因不會(huì)整合到細(xì)胞的基因組上，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)分裂，外源基因會(huì)逐漸消失，而大量的藥理學(xué)研究需要的周期較長(zhǎng)。而本文提供了構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hOAT1的方法，解決了目的蛋白鑒定繁瑣、轉(zhuǎn)染方法復(fù)雜及轉(zhuǎn)染效率低等問(wèn)題，所得細(xì)胞模型靈敏、穩(wěn)定、可靠。

綜上所述，穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-hOAT1的HEK293細(xì)胞株的建立，可用于確定 hOAT1的底物和抑制劑，為進(jìn)一步研究核苷類(lèi)膦酸類(lèi)似物類(lèi)藥物引起的臨床劑量依賴性腎毒性的機(jī)制奠定模型基礎(chǔ)。