戴臨風(fēng)，謝兆玉，金佳琪，賴潔青，連大衛(wèi)，黃琳硯，黃 怡3,，陳 揚(yáng)

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；3. 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔醫(yī)療中心，廣東 廣州 510630；4.暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510630)

1 背景

牙周炎是非特異性的慢性感染性疾病,牙頸部及齦溝內(nèi)牙菌斑中的微生物是其主要感染源,是常見(jiàn)的口腔慢性疾病，也是牙齒非正常脫落的重要原因，嚴(yán)重威脅著我國(guó)居民的口腔健康。根據(jù)衛(wèi)計(jì)委2017年第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示在35～44歲居民中，口腔內(nèi)牙石檢出率為96.7%，與10年前持平；牙齦出血檢出率為87.4%比十年前上升了10.1%。牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts, PDLFs)可以對(duì)牙周組織進(jìn)行修復(fù)和改建，是牙周膜組織中數(shù)目最大、最主要的細(xì)胞類型，對(duì)牙周炎發(fā)展過(guò)程具有重要作用[1]。牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis,P.g)是牙周炎的主要致病菌，是牙周膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的主要因素[2]。

近代張錫純提出牙疼是因?yàn)槲笩嵘涎?，血熱并于牙齦作痛，并伴有牙齦出血潰爛，因此治宜清熱止血；大黃是臨床常用的清熱止血藥，有臨床報(bào)告表示在牙周袋局部用大黃治療牙周炎能有效阻斷炎癥的發(fā)展[3]。蘆薈大黃素(aloe-emodin, AE)是大黃重要的蒽醌類有效成分，有較強(qiáng)的抗厭氧菌及抗炎作用，且極佳的抗氧化損傷的作用[4]。但關(guān)于AE抗炎機(jī)制的研究卻少見(jiàn)報(bào)道。因此本研究通過(guò)觀察AE對(duì)牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Porphyromonasgingivalislipopolysaccharide, P.g-LPS)誘導(dǎo)牙周膜成纖維細(xì)胞Nlrp3炎癥小體活化的影響，探討其機(jī)制。

2 材料和方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑

2.1.1小鼠牙周膜成纖維細(xì)胞(mouse periodontal ligament fibroblasts, mPDLFs)購(gòu)自武漢Procell公司，貨號(hào)：CP-M199。

2.1.2P.g-LPS(tlrl-pglps)、AE(A7687)購(gòu)自美國(guó)sigma公司。

2.1.30.25%胰酶(25200056)、DMEM培養(yǎng)基(11995065)、胎牛血清(FBS) (16140071)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ROS試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物研究所(E004)；蛋白酶抑制劑(Cocktail)購(gòu)自美國(guó)sigma公司；RIPA Buffer購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；脫脂牛奶購(gòu)自美國(guó)Becton, Dickinson and Company；BCA試劑盒(P0028)及蛋白上樣緩沖液購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；anti-β-actin(BM0627)(1 ∶1 000)購(gòu)自中國(guó)BOSTER；anti-caspase-1(sc-514)(8∶5 000)購(gòu)自美國(guó)Santa公司；anti-Nlrp3(15101S)(1∶1 000)、anti-TXNIP(14715S)(1∶1 000)、anti-rabbit IgG(7074S)(1∶1 500)、anti-mouse IgG(4408S)(3∶5 000)購(gòu)自美國(guó)CST公司；PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNAEeaser(RR047A)購(gòu)自TaKaRa公司；RNAiso Plus、SYBR GREEN(RR820A)購(gòu)自日本TaKaRa公司。

2.1.4化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(TANON 5200)購(gòu)自中國(guó)TANON公司；實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(CFX96 TouchTM)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)和給藥小鼠牙周膜成纖維細(xì)胞以10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，每2～3天傳代。將無(wú)血清的DMEM將0.25%胰酶稀釋3倍用于消化。P.g-LPS來(lái)自牙齦卟啉單胞菌，用培養(yǎng)基溶解并稀釋至2 μg·mL-1作為刺激劑；AE以0.05、0.1、0.3、0.5 μmol·L-1濃度分別給藥，并在上述環(huán)境中培養(yǎng)24 h備用。

2.3活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS) 實(shí)驗(yàn)采用DCFH-DA作為活性氧探針。細(xì)胞鋪板后6 h給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗。將DCFH-DA按1 ∶4 000用培養(yǎng)基稀釋后，加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃孵育30 min，并在熒光顯微鏡下觀察。0.25%胰酶消化細(xì)胞后，1 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，PBS洗兩次，離心收集細(xì)胞沉淀物。將收集好的細(xì)胞沉淀物用PBS重懸，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)激發(fā)光波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm。

2.4Westernblot總蛋白利用RIPA法提取，并用BCA法測(cè)總蛋白濃度。加入適量蛋白上樣緩沖液并在100℃中變性5分鐘，隨后4℃保存?zhèn)溆?。利?2% SDS-PAGE凝膠110V恒壓分離，之后110V恒壓轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。利用5%脫脂牛奶為封閉液，封閉2 h。對(duì)應(yīng)的一抗在室溫下孵育1 h后轉(zhuǎn)移至4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h。最后用Tanon化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)采集圖像，并分析灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5RNA的提取和實(shí)時(shí)定量PCR總RNA用RNAiso Plus提取。總RNA利用UV-Vis測(cè)定濃度，A260/A280值均在1.8～2.2范圍內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，依照說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量PCR用SYBR Green Realtime PCR Master Mix采用兩步法進(jìn)行反應(yīng)，第一步 95℃ 30秒，第二步 95℃ 5秒； 60℃ 30秒循環(huán)40次。實(shí)驗(yàn)利用Real-Time PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)重復(fù)三次。引物序列如下： 小鼠Nlrp3基因：5′-ATTRACCRCGCRCCGRAGARAAGRG-3′ (forward primer)，5′- TCGRCAGRCAARAGARTCCRACARCAG -3′ (reverse primer)； 小鼠caspase-1基因：5′-GAGCTGATGTTGACCTCAGAG-3′ (forward primer)，5′- CTGTCAGAAGTCTTGTGCTCTG -3′ (reverse primer)； 內(nèi)參基因?yàn)棣?actin：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′(forward primer)，5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′ (reverse primer)。

3 結(jié)果

3.1AE對(duì)mPDLFs產(chǎn)生ROS能力及硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)表達(dá)量的影響如圖1所示，P.g-LPS刺激mPDLFs 24 h后，ROS的產(chǎn)生量明顯高于空白對(duì)照組。在使用AE治療后，ROS的產(chǎn)生被抑制，并在0.5 μmol·L-1時(shí)降到最低，與模型組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P.g-LPS使小鼠牙周膜成纖維細(xì)胞中TXNIP的表達(dá)明顯增高。在給予AE后，TXNIP的表達(dá)有下降的趨勢(shì)，當(dāng)AE的劑量在0.5 μmol·L-1時(shí)與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2AE對(duì)P.g-LPS誘導(dǎo)mPDLFs中Nlrp3表達(dá)量影響P.g-LPS使mPDLFs中Nlrp3的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于空白對(duì)照組。給予AE后，隨著AE劑量的增加，其轉(zhuǎn)錄水平隨之降低。在WB實(shí)驗(yàn)中，模型組的Nlrp3的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，給予不同濃度AE后也隨之下降。AE對(duì)Nlrp3的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的阻斷自最小劑量開(kāi)始與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.3AE對(duì)P.g-LPS誘導(dǎo)mPDLFs中前體caspase-1(pro-caspase-1)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)及活化caspase-1(cle-caspase-1)表達(dá)的影響模型組的前體caspase-1的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于空白對(duì)照組，給予AE后，隨著AE劑量的增加，其轉(zhuǎn)錄水平隨之降低。同時(shí)，模型組的前體caspase-1的蛋白表達(dá)量及相應(yīng)的活化caspase-1均明顯高于空白對(duì)照組，給予不同濃度AE后均隨之下降。前體caspase-1的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)量均當(dāng)AE在0.5 μmol·L-1時(shí)與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與前體caspase-1相似，P.g-LPS令mPDLFs大量表達(dá)活化caspase-1，當(dāng)給予AE治療后其表達(dá)量下降，并自0.3 μmol·L-1的劑量開(kāi)始與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 討論

本研究證明AE對(duì)P.g-LPS引起的牙周膜成纖維細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用是通過(guò)抑制P.g-LPS引起的牙周膜成纖維細(xì)胞ROS-TXNIP通路活化，減緩Nlrp3-inflammasome組成蛋白的聚集及活化程度實(shí)現(xiàn)的，除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)AE的保護(hù)作用具有濃度依賴性的變化。

在近年來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)，牙周炎作為一種頑固性的慢性病變，它的發(fā)生發(fā)展與Nlrp3-inflammasome關(guān)系密切，其重要原因是Nlrp3-inflammasome被認(rèn)為是慢性疾病的中心致病環(huán)節(jié)[5-6]。Nlrp3-inflammasome可以調(diào)控細(xì)胞焦亡[7]、破壞細(xì)胞骨架[8]、影響細(xì)胞功能蛋白的合成、代謝或分泌[9]等細(xì)胞功能和活力。Nlrp3-inflammasome，由三部分構(gòu)成：Nlrp3蛋白與銜接蛋白——ASC及細(xì)胞凋亡蛋白酶前體(pro-caspase-1)[10]。研究指出，P.g作為導(dǎo)致牙周炎的主要病原體，其分泌的P.g-LPS可以通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌IL-1，IL-6，IL-8，TNF和前列腺素E等多種炎性介子導(dǎo)致牙周結(jié)締組織的破壞和牙槽骨的吸收[2]。而某些特定的炎性介質(zhì)如IL-1與Inflammasome關(guān)系密切。由上不難看出，Nlrp3炎癥小體通路是抗炎藥物發(fā)揮藥效的潛在靶點(diǎn)[5]，因此在本研究中，將AE的抗炎作用是否與Nlrp3炎癥小體關(guān)聯(lián)作為研究重點(diǎn)。活化caspase-1來(lái)自于活化的Nlrp3-inflammasome對(duì)前體caspase-1的剪切，是Nlrp3-inflammasome最終發(fā)揮病理生理活性的重要“效應(yīng)器”[11]；它的生成使IL-1β、IL-18等炎性介質(zhì)大量釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，造成細(xì)胞的損傷，因而阻斷活化caspase-1的生成是AE抑制Nlrp3-inflammasome活性的關(guān)鍵標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)證明活化caspase-1的活化程度的減弱與AE劑量呈依賴性關(guān)系，這一現(xiàn)象反映了AE可以降低Nlrp3-inflammasome的聚集及活化。為了探究AE抑制Nlrp3-inflammasome活化的機(jī)制，我們首先檢測(cè)了Nlrp3及前體caspase-1的基因與蛋白表達(dá)，0.05至0.5μmol·L-1的AE均可以明顯的降低Nlrp3的基因和蛋白表達(dá)，然而僅在AE最大劑量(0.5 μmol·L-1)時(shí)候可以抑制前體caspase-1的基因和蛋白，基于此我們推測(cè)AE可能通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄水平抑制了Nlrp3-inflammasome相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻斷了活化途徑。

同時(shí)我們?yōu)榱诉M(jìn)一步的說(shuō)明AE抑制Nlrp3-inflammasome聚集及活化的作用通路，我們初步嘗試探究了影響Nlrp3-inflammasome活化的主要應(yīng)答機(jī)制——氧化應(yīng)激作用。研究指出，抗氧化能力的喪失是導(dǎo)致牙周炎的關(guān)鍵因素，過(guò)量生成的ROS對(duì)mPDLFs有明顯的促炎作用，是mPDLFs發(fā)生病理?yè)p傷的早期信號(hào)，直接導(dǎo)致了后續(xù)的牙周組織的病理?yè)p傷并導(dǎo)致附著喪失乃至失牙[11-12]。過(guò)量產(chǎn)生的ROS可通過(guò)活化多種促炎轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)Nlrp3及其下游蛋白的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)量[13]，其中包括NF-κB，這是Nlrp3-inflammasome發(fā)揮作用的關(guān)鍵調(diào)控因子[10]。在以往的報(bào)道中AE具備重要的抗氧化性[4]，我們的結(jié)果也同樣表明P.g-LPS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞釋放大量的ROS，而AE表現(xiàn)出清除ROS的作用。同時(shí)最近一項(xiàng)研究表明，由于活性氧(ROS)過(guò)度累積而被切割分離的TXNIP能與Nlrp3形成聚合物，大幅促進(jìn)了Nlrp3的聚集，最終形成高度活化的Nlrp3-inflammasome六聚體復(fù)合物，具有強(qiáng)大的生理病理活性[14-15]。進(jìn)而我們繼續(xù)檢測(cè)與ROS密切相關(guān)的TXNIP表達(dá)，其在AE最大劑量(0.5 μmol·L-1)下出現(xiàn)明顯降低的結(jié)果，這與AE抑制Nlrp3-inflammasome活化結(jié)果遙相呼應(yīng)。所以我們認(rèn)為AE可能通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生調(diào)節(jié)TXNIP在細(xì)胞內(nèi)的釋放從而抑制Nlrp3-inflammasome聚集活化起到防治牙周膜成纖維細(xì)胞慢性損傷的作用。

Fig 1 The effect of AE on ROS production and TXNIP expression in mPDLFs induced by P.g-LPS.A and B the effect of AEon ROS production in P.g-LPS-induced mPDLFs. C and D the effect of AE on TXNIP expression in P.g-LPS-induced mPDLFs .

ΔΔP<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel (P.g-LPS)

Fig 2 The effect of AE on the transcription and expression of Nlrp3 in mPDLFs induced by P.g-LPS.

ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel (P.g-LPS)

Fig 3 The effect of AE on the transcription and expression of Pro-caspase-1 andcle-caspase-1 expression in mPDLFs induced by P.g-LPS.

ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vscontrol；*P<0.05,**P<0.01vsmodel (P.g-LPS)

綜上所述，我們認(rèn)為AE可以減少Nlrp3、前體caspase-1及活化caspase-1的生成而阻斷Nlrp3-inflammasome活化的通路，其是通過(guò)抑制ROS-TXNIP介導(dǎo)的Nlrp3-inflammasome的聚集過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)此通路共同抑制了P.g-LPS誘導(dǎo)的牙周膜成纖維細(xì)胞Nlrp3-inflammasome活化是AE表現(xiàn)出抗早期炎癥的重要機(jī)制之一。因此，本研究證明AE在輔助治療牙周炎方面有極大的潛能，并為治療慢性牙周炎提供了新的作用靶點(diǎn)和藥物選擇方向。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥心血管藥理實(shí)驗(yàn)室完成，非常感謝本課題組全體老師和同學(xué)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。)