崔曉霞，束紅梅，蔣璐，何曉蘭，鞏元勇，倪萬潮，郭書巧

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甜葉菊褐斑病的病原菌鑒定及MeJA的抗病作用

崔曉霞，束紅梅，蔣璐，何曉蘭，鞏元勇，倪萬潮，郭書巧

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，南京 210014）

【目的】明確引起甜葉菊褐斑病的病原菌種類，分析MeJA在甜葉菊響應(yīng)鏈格孢菌過程中的作用，為甜葉菊褐斑病的防治及抗病育種提供依據(jù)?！痉椒ā繉θ∽越K省東臺市富安鎮(zhèn)甜葉菊生產(chǎn)基地的發(fā)病甜葉菊植株的葉片進(jìn)行病原菌分離、純化培養(yǎng)，觀察菌落及分生孢子的形態(tài)、大小和病原菌的致病性。采用離體葉片接種的方法進(jìn)行致病性測定。利用真菌通用引物ITS1和ITS4對7個致病菌株ST1-ST7的rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和測序，并利用MEGA 7軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建基于病原菌的rDNA-ITS序列和GenBank中相關(guān)鏈格孢菌序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌的種類。利用臺盼藍(lán)染色、光學(xué)顯微鏡觀察分析鏈格孢菌分生孢子在甜葉菊葉片上的萌發(fā)狀態(tài)及侵入葉片的方式。通過向馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）上外源添加MeJA分析其對鏈格孢菌菌絲生長的影響；對甜葉菊離體葉片飼喂MeJA并接種鏈格孢菌，觀察葉片對鏈格孢菌的抗性；采用qPCR方法分析JA通路相關(guān)基因在甜葉菊葉片接種鏈格孢菌前后的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】從甜葉菊發(fā)病葉片上共分離到7個菌株，所有菌株在PDA培養(yǎng)基上呈近圓形等徑輻射生長，氣生菌絲較為發(fā)達(dá)，初期為白色，后期逐漸變?yōu)椴煌潭鹊幕液谏?，分生孢子單生或成鏈，多為近球形、倒棒狀或倒梨形，大小為?0.5—45.5）×（6.5—16.0）μm。將所分離得到的菌株接種于甜葉菊離體葉片上，發(fā)現(xiàn)7個菌株對甜葉菊葉片致病程度存在一定差異，ST2、ST3和ST7 3個菌株侵染葉片后病斑擴(kuò)展速度快，致病力較強(qiáng)。3個致病力較強(qiáng)的菌株的rDNA-ITS序列長度分別為569、570和570 bp，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，ST2、ST3與菌株KY814634.1、DQ491089.1等（、sp.，鏈格孢）的相似度達(dá)到99%—100%，ST7與菌株HQ402558.1（，細(xì)極鏈格孢）的相似度達(dá)到99%。對接種細(xì)極鏈格孢ST7分生孢子的甜葉菊葉片臺盼藍(lán)染色后的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分生孢子可以從孢子的頭部、側(cè)面、尾部多個位置萌發(fā)，從葉片的氣孔和表皮細(xì)胞間隙侵入葉片表皮細(xì)胞內(nèi)。外源施加濃度高于200 μmol·L-1的MeJA能有效抑制細(xì)極鏈格孢菌絲的生長；甜葉菊離體葉片飼喂100 μmol·L-1的MeJA后接種細(xì)極鏈格孢，病斑面積明顯小于對照，表明MeJA可增強(qiáng)甜葉菊對細(xì)極鏈格孢的抗性；JA通路相關(guān)基因和在甜葉菊接種細(xì)極鏈格孢后上調(diào)表達(dá)，和反之下調(diào)表達(dá)，表明JA通路參與甜葉菊對細(xì)極鏈格孢的響應(yīng)。【結(jié)論】江蘇省東臺市富安鎮(zhèn)甜葉菊生產(chǎn)基地甜葉菊褐斑病的致病菌為鏈格孢菌。細(xì)極鏈格孢菌絲可以從葉片的氣孔以及表皮細(xì)胞間隙侵入表皮細(xì)胞。外源施加MeJA能夠有效增強(qiáng)甜葉菊葉片對細(xì)極鏈格孢的抗性，在甜葉菊褐斑病的防治中具有很好的應(yīng)用前景。

甜葉菊；褐斑?。绘湼矜呔?；病原菌鑒定；MeJA；信號通路

0 引言

【研究意義】甜葉菊（）是菊科、甜葉菊屬多年生草本植物。甜葉菊葉片富含黃酮類和甜菊糖苷類化學(xué)成分[1-2]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性；甜菊糖苷（steviol glycosides）則是一類新型天然甜味劑，具有甜度高、熱量低、安全無毒等特點(diǎn)[3]，逐漸成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究開發(fā)的熱點(diǎn)[4-5]。2017年筆者在江蘇省東臺市富安鎮(zhèn)甜葉菊生產(chǎn)基地發(fā)現(xiàn)甜葉菊葉片上呈現(xiàn)不同程度的褐斑，發(fā)病嚴(yán)重的植株葉片全部枯萎，嚴(yán)重影響了甜葉菊的產(chǎn)量。因此，確定甜葉菊褐斑病的致病病原菌，對該病害的防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】鏈格孢菌是自然界中廣泛存在、危害嚴(yán)重的一種死體營養(yǎng)型植物病原真菌，多生于植物的枯死部分和衰弱瀕死的組織，或腐生于多種有機(jī)物質(zhì)上或土壤中[6]。鏈格孢菌可引起多種植物特別是農(nóng)作物病害，能夠引起包括小麥、馬鈴薯、玉米、煙草、番茄、蘋果、梨等幾十種農(nóng)作物的真菌性病害，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。美國伊利諾斯州的大豆曾因細(xì)極鏈格孢（）引起的大豆猝倒病，造成產(chǎn)量損失15%[8]。由長柄鏈格孢（）和鏈格孢（）引起的煙草赤星病在世界各主要煙區(qū)廣泛發(fā)生，主要危害成熟期煙葉，對成熟度、采收率、外觀等級和內(nèi)在質(zhì)量都有很大影響，是煙草的主要病害之一[9-10]。我國各地廣泛發(fā)生的番茄、馬鈴薯等茄科蔬菜的早疫病，則是由為主的病原真菌引起的[11-12]。1982年，日本首次發(fā)現(xiàn)一種鏈格孢屬真菌能引起甜葉菊黑斑病[13]，病斑呈黑色不規(guī)則形狀擴(kuò)展，并被褪綠區(qū)域包圍；2007年，印度也首次報道了導(dǎo)致甜葉菊葉斑病的病原菌，鑒定結(jié)果為鏈格孢[14]；伊朗于2015年首次分離鑒定到鏈格孢菌屬為引起甜葉菊葉斑病的致病病原菌[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國內(nèi)關(guān)于甜葉菊病害病原物鑒定方面的報道還很少，對鏈格孢菌的防控并沒有非常有效的方法，因此了解其侵染機(jī)理可為該真菌導(dǎo)致的病害防控提供指導(dǎo)。對2017年7月采自江蘇省東臺市富安鎮(zhèn)甜葉菊生產(chǎn)基地的帶病斑甜葉菊葉片進(jìn)行病原菌分離鑒定和致病性檢測，并進(jìn)一步分析MeJA對甜葉菊響應(yīng)鏈格孢菌的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)手段鑒定甜葉菊褐斑病的致病病原菌，明確甜葉菊褐斑病的病原菌種類；分析MeJA對甜葉菊響應(yīng)鏈格孢菌的影響以及JA通路是否參與該響應(yīng)過程，為該病害的田間診斷、綜合防控及甜葉菊的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2017年7月至2018年4月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所完成。

1.1 褐斑病標(biāo)樣采集及病原菌分離

2017年7月從江蘇省東臺市富安鎮(zhèn)甜葉菊生產(chǎn)基地采集葉片帶有褐斑的植株。選取葉片病健交界的組織，切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，首先用無菌水沖洗數(shù)次，用70%酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞處理2 min，用無菌水漂洗3次，最后用滅菌鑷子夾取材料平鋪于添加有鏈霉素（40 μg·mL-1）的PDA平板培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3—5 d，從新長出的菌落邊緣挑取少量菌絲接種到新的PDA平板上進(jìn)一步分離純化，記錄菌落的形態(tài)學(xué)特征。

1.2 病原菌的致病性測定

選擇健康無病、無傷痕的甜葉菊葉片，室內(nèi)進(jìn)行離體葉片接種試驗。每個菌株均為3次重復(fù)。用70%酒精進(jìn)行表面消毒后置于鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。

菌絲塊接種法：分離純化的菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d，用滅菌刀沿菌落邊緣切取3 mm×3 mm大小的菌餅，菌絲面朝下、避開主葉脈貼于葉片背面兩側(cè)，接種部位用刺針進(jìn)行人工創(chuàng)傷。同時接種空白的PDA培養(yǎng)基塊作為對照。接種后封好培養(yǎng)皿，置于25℃條件下誘導(dǎo)發(fā)病，每天觀察并記錄發(fā)病情況。

分生孢子懸浮液接種法：將菌株在PDA平板上于黑暗條件下培養(yǎng)10 d，加入10 mL無菌水刮洗菌絲，所得到的懸浮液經(jīng)3層紗布過濾，在顯微鏡下使用血球計數(shù)板來計算孢子懸浮液的濃度，最終將孢子懸浮液濃度調(diào)至1×105個/mL。將表面消毒處理后的甜葉菊葉片浸到孢子懸浮液中10 min，然后將其轉(zhuǎn)移到鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于25℃條件下培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)以及侵染情況。

待接種后的甜葉菊葉片發(fā)病后，根據(jù)柯赫式法則，將病原菌重新進(jìn)行分離純化，觀察新分離物與接種菌是否相同。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的致病菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)8 d后，從菌落邊緣表面切取小塊薄的、帶菌絲的培養(yǎng)基，將其放置到載玻片上，覆上中心鑿有1 cm2方孔的紙片，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡（Olympus CX41，Japan）下觀察分生孢子、分生孢子梗及分生孢子鏈的形態(tài)并拍照，用目鏡測微尺測量分生孢子的大小。結(jié)合病原菌菌落在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)及色澤特征，參考《真菌鑒定手冊》[16]確定病原菌的種類。

1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 總DNA的提取 將分離得到的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，從培養(yǎng)基表面刮取菌絲，加入液氮迅速研磨成粉末，參照真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，China）操作說明提取菌株DNA，并將DNA樣品放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 ITS區(qū)擴(kuò)增 采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對病原菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：DNA模板2 μL、上下游引物ITS1和ITS4各1 μL、10×PCR buffer（Mg2+plus）5 μL、dNTP Mixs（10 mmol·L-1）1 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、無菌ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共33個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4.3 PCR產(chǎn)物純化與克隆 取5 μL 1.4.2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 6×DNA loading buffer混勻，于1%瓊脂糖凝膠上檢測樣品條帶大小是否正確并特異。檢測正確的PCR產(chǎn)物使用PCR清潔試劑盒（Axygen，USA）回收純化，將其與pEASY-T1克隆載體（TransGen，China）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（TransGen，China）中，經(jīng)PCR鑒定后，選取陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4.4 病原菌的ITS序列分析 將測得的ITS區(qū)序列在GenBank中進(jìn)行同源性搜索，與已報道真菌菌株的ITS區(qū)序列進(jìn)行同源性比較。利用MEGA 7軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將比較結(jié)果與病菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和致病性結(jié)合，對病原菌進(jìn)行鑒定。

1.5 細(xì)胞學(xué)染色

等體積的乳酸、苯酚、甘油和無菌ddH2O混合，制成乳酸酚溶液；向其中加入Trypan Blue染料溶解，使其終濃度為2.5 mg·mL-1，配成Trypan Blue染液。

Trypan Blue染液中加入2倍體積的無水乙醇，將樣品置于染色液中100℃煮1 min，室溫放置5—10 min；轉(zhuǎn)移至無水乙醇﹕乳酸酚=2﹕1溶液中過夜脫色，重復(fù)直至葉片綠色完全褪去；樣品于70%甘油中保存，制片并觀察。

1.6 MeJA對鏈格孢菌生長的影響

1.6.1 MeJA培養(yǎng)基的配制 取223.6 μL的MeJA溶于10 mL無水乙醇中，配成100 mmol·L-1的濃縮液，分別加入到PDA培養(yǎng)基中配成0、40、100、200、500 μmol·L-1含不同濃度MeJA的混合培養(yǎng)基。

1.6.2 菌絲生長檢測 鏈格孢菌株ST3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，用打孔器在菌落邊緣均勻打下菌絲塊，將菌絲塊分別放在上述含不同濃度MeJA的PDA平板中央，每個處理重復(fù)6次。將其置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每2 d觀察并測量菌落直徑。

1.7 離體葉片飼喂及培養(yǎng)

選擇生長狀態(tài)良好、長勢一致的甜葉菊植株，剪取離體葉片放入鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙加滅菌水浸濕，用浸泡100 μmol·L-1MeJA溶液的無菌棉包裹葉柄切口，進(jìn)行離體飼喂，對照用浸泡無菌水的棉球處理。室溫下靜置10 h后取下棉球，重新用無菌水浸濕的棉球包裹葉柄處（方法參照Sun等[17]）。接種方法參照1.2的菌絲塊接種法。接種后的葉片置于培養(yǎng)皿中于溫度28/23℃、光周期16/8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后3、4、5 d測量病斑并拍照記錄。

1.8 RNA提取及qRT-PCR

樣品RNA的提取采用E.Z.N.A.?Plant RNA Kit（OMEGA，美國）試劑盒，按照說明書進(jìn)行RNA的提取操作?；蚪MDNA去除及RNA反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，Japan）試劑盒并按說明書操作。

qRT-PCR采用SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，Japan）試劑盒，PCR反應(yīng)在QuantStudio 5 Real-Time PCR System（Applied Biosystems，American）儀器上進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增Ct值經(jīng)QuantStudioTMDesign & Analysis Software 1.3.1軟件初步處理后導(dǎo)出至Excel中，利用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)采用Dunnett’ s test進(jìn)行顯著性分析。所用甜葉菊內(nèi)參基因及JA通路各目的基因引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用引物核酸序列

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)特征

從甜葉菊守田3號發(fā)病葉片中分離出7種疑似致病真菌，依次編號為ST1—ST7。所有菌株在PDA培養(yǎng)基上呈近圓形等徑輻射生長，邊緣光滑略呈波浪狀；氣生菌絲較為發(fā)達(dá)，初期為白色，后期逐漸變?yōu)椴煌潭鹊幕液谏?，基質(zhì)呈現(xiàn)不同類型的同心輪紋（圖1）；在PDA平板上培養(yǎng)8 d的菌落產(chǎn)生大量的分生孢子，顯微鏡下觀察，分生孢子梗直立或略彎，分隔，偶分枝，淡褐色，大小為（24.0—77.5）×（2.3—5.0）μm；分生孢子單生或成鏈，形態(tài)多樣，多為近球形、倒棒狀或倒梨形，大小為（20.5—45.5）×（6.5—16.0）μm（圖2）。其中ST2、ST3、ST5、ST6具有短分枝的孢子鏈，作合軸式延伸，分生孢子表面光滑或具微刺，具3—8個橫膈膜和1—4個縱、斜隔膜；ST1、ST4、ST7則形成超過10個孢子的分生孢子長鏈，少分支，處于鏈基部的孢子，表面偶生明顯的疣突，分生孢子具4—7個橫膈膜，1—4個縱或斜隔膜，常有1—4個主橫膈膜，主隔膜處有明顯的隘縮。根據(jù)這些特征，參照魏景超的《真菌鑒定手冊》[16]及張?zhí)煊畹摹吨袊婢尽穂6]初步判定此類菌為鏈格孢屬霉菌，其中ST2、ST3、ST5、ST6可能是，ST1、ST4、ST7則推測是。

ST1—ST7在PDA平板上25℃條件下培養(yǎng)10 d后的正面和反面菌落形態(tài)

圖2 分離病原真菌分生孢子形態(tài)的顯微觀察

2.2 病原菌的致病性檢測

采用離體葉片接種的方法，對葉片發(fā)病情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個菌株對甜葉菊葉片致病程度存在一定的差異，ST2、ST3和ST7 3個菌株侵染葉片后病斑擴(kuò)展速度快，在接種后72 h病斑直徑達(dá)到3—5 mm，發(fā)病位置呈黑褐色（圖3-B、3-C、3-G），而ST1、ST4、ST5和ST6在接種后的第7天病斑仍局限于葉片的創(chuàng)傷位點(diǎn)（圖3-A、3-D、3-E、3-F）。因此，引起甜葉菊葉片褐斑病的ST2、ST3和ST7菌株的致病力較強(qiáng)，而ST1、ST4、ST5和ST6對甜葉菊的致病力則相對較弱。從接種發(fā)病的葉片病斑上刮取少量的病組織鏡檢，可觀察到與接種菌株一致的菌絲和分生孢子。對發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的再分離，同樣獲得與接種病原真菌菌落形態(tài)一致的培養(yǎng)物，完成柯赫氏法則（Koch postulates）致病性檢測。因此，接種所用的菌株是引起甜葉菊褐斑病的病原菌。

A—G：甜葉菊葉片分別接種ST1-ST7菌株的表型The phenotype of S. rebaudiana leaves inoculated with ST1-ST7 strains, respectively；H：接種無菌空白PDA培養(yǎng)基的對照The control leaf inoculated with PDA medium

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析

以菌株ST1—ST7的基因組DNA為模板，利用真菌rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4，擴(kuò)增得到571、569、570、570、570、571和570 bp大小的ITS序列（圖4），并進(jìn)行測序分析，將測序結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對（圖5）。結(jié)果表明，ST2、ST3、ST5、ST6與KY075667.1、KY814634.1等8個菌株（、sp.）的相似性達(dá)到99%—100%，ST1、ST4、ST7與HQ402558.1（）的相似性達(dá)到99%，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，進(jìn)一步確認(rèn)引起甜葉菊褐斑病的病原菌為鏈格孢和細(xì)極鏈格孢。

2.4 細(xì)極鏈格孢分生孢子在葉片上的萌發(fā)及侵入

甜葉菊品種守田3號葉片接種細(xì)極鏈格孢ST7（以下試驗將該菌株作為研究對象）分生孢子懸浮液（1×105個/mL），利用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種6 h后，分生孢子已經(jīng)開始萌發(fā)，分生孢子可以從孢子的頭部、側(cè)面、尾部多個位置萌發(fā)（圖6-A、6-B、6-C），菌絲沿葉片表面蔓延生長。接種24 h后，對菌絲侵入表皮細(xì)胞的方式進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)一部分菌絲通過葉片的氣孔侵入表皮細(xì)胞（圖6-D、6-E、6-F），一部分則從表皮細(xì)胞間隙直接侵入葉片表皮細(xì)胞內(nèi)（圖6-G、6-H）。

圖4 7株鏈格孢菌的rDNA-ITS PCR產(chǎn)物電泳圖

2.5 JA通路參與甜葉菊對鏈格孢菌的響應(yīng)

2.5.1 MeJA對鏈格孢菌菌絲生長的影響 選擇細(xì)極鏈格孢菌株ST7在含有不同濃度MeJA的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲生長面積統(tǒng)計結(jié)果如圖7所示。MeJA濃度低于200 μmol·L-1時，菌落生長面積與對照相比無明顯差異；當(dāng)MeJA濃度增至200 μmol·L-1時，鏈格孢菌菌絲的生長受到明顯抑制，且隨著MeJA濃度增至500 μmol·L-1，對其生長的抑制效果更顯著。MeJA在較低濃度范圍內(nèi)對細(xì)極鏈格孢菌ST7沒有直接的抑制作用，因此，選擇濃度為100 μmol·L-1的MeJA用于后續(xù)的試驗處理。

2.5.2 外源施加MeJA增強(qiáng)甜葉菊對細(xì)極鏈格孢的抗性 對外源施加100 μmol·L-1MeJA的甜葉菊離體葉片接種細(xì)極鏈格孢ST7菌絲塊，同時對葉片接種無菌PDA培養(yǎng)基作為空白對照。接種后的病斑表型如圖8-A所示，相比于對照H2O處理的葉片，MeJA處理后甜葉菊葉片的病斑明顯減小。病斑統(tǒng)計結(jié)果（圖8-B）顯示，接種后3、4、5 d，對照葉片的病斑面積分別是MeJA處理后葉片病斑面積的1.41、1.50和1.58倍，結(jié)果表明外源施加MeJA后，甜葉菊葉片對細(xì)極鏈格孢ST7的抗性明顯增強(qiáng)。

圖5 甜葉菊褐斑病7個致病菌與鏈格孢菌屬相關(guān)種rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

甜葉菊品種守田3號接種細(xì)極鏈格孢ST7 6 h后，分生孢子從孢子的頭部（A）、側(cè)面（A、B）、尾部萌發(fā)（C）；接種24 h后，菌絲從葉片氣孔（D、E、F）、表皮細(xì)胞間隙（G、H）侵入葉片表皮細(xì)胞內(nèi)

圖7 MeJA對細(xì)極鏈格孢ST7菌絲生長的影響

I：甜葉菊葉片飼喂100 μmol·L-1 MeJA 10 h后接種細(xì)極鏈格孢ST7的表型The phenotype of S. rebaudiana leaves which inoculated with ST7 after feeding 100 μmol·L-1 MeJA for 10 h；II：葉柄處飼喂ddH2O后接種細(xì)極鏈格孢ST7的表型The phenotype of S. rebaudiana leaves which inoculated with A. tenuissima ST7 after petiole feeding ddH2O；III：葉片飼喂ddH2O并接種無菌PDA培養(yǎng)基的空白對照 The control which leaves inoculated with PDA medium。拍照及測量病斑時間點(diǎn)均為接種后3、4、5 d The time points for taking pictures and measuring the disease spots are 3, 4, 5 days after inoculation

2.5.3 JA通路相關(guān)基因的表達(dá)分析是JA合成通路基因，在甜葉菊葉片接種細(xì)極鏈格孢菌株ST7分生孢子懸浮液12 h后，明顯上調(diào)表達(dá)；JAR則是JA通路中的信號傳導(dǎo)因子，在接種后48 h后，的表達(dá)量顯著增加；JAZ是茉莉酸途徑的抑制因子，接種鏈格孢菌后，和呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)（圖9）。表明JA通路相關(guān)基因參與甜葉菊對細(xì)極鏈格孢ST7的響應(yīng)。

3 討論

甜葉菊提取物甜菊糖苷作為甜味食品添加劑在南美已使用了數(shù)個世紀(jì)[18]，最近在歐盟和美國也被批準(zhǔn)使用[19]。甜菊糖苷同時具有一定的藥用價值，例如降低血壓、增強(qiáng)胰島細(xì)胞功能治療2型糖尿病、預(yù)防動脈粥樣硬化、預(yù)防某些癌癥以及清除人體自由基等功能[19-22]。我國的甜葉菊自1976年南京中山植物園從日本引種試驗成功后，80年代初全國各地開始種植[23]。自2006年起，中國成為世界甜菊糖產(chǎn)品最大的出口國[4]。目前關(guān)于甜葉菊病害已有相關(guān)報道。2002年，朱東順等[24]在山東省高密地區(qū)發(fā)現(xiàn)甜葉菊生產(chǎn)中發(fā)生的主要病害有立枯病、花葉病毒病和葉斑病等，對甜葉菊的干葉質(zhì)量和產(chǎn)量均造成不同程度的影響。近年來甘肅河西走廊地區(qū)甜葉菊育苗期的病害呈逐年加重的趨勢，猝倒病、立枯病和葉斑病成為育苗期最容易發(fā)生的3大病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大損失[25]。2017年，筆者在江蘇省東臺市富安鎮(zhèn)甜葉菊生產(chǎn)基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)甜葉菊葉片上呈現(xiàn)不同程度的褐斑，發(fā)病嚴(yán)重的植株葉片全部枯萎。經(jīng)病原菌的分離、培養(yǎng)、純化，共分離得到7株病原真菌，均為鏈格孢屬真菌，致病性鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3株致病力較強(qiáng)，為細(xì)極鏈格孢和鏈格孢。

圖9 JA通路相關(guān)基因響應(yīng)細(xì)極鏈格孢侵染的表達(dá)分析

JA是植物細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的重要信號分子，通過與轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用來調(diào)控防御蛋白的表達(dá)以及次生物質(zhì)的合成，參與植物對病原菌的應(yīng)答反應(yīng)和信號傳遞[26-27]。本試驗表明，100 μmol·L-1的MeJA對鏈格孢菌無直接抑制作用，而用該濃度MeJA處理后的甜葉菊葉片對鏈格孢菌的抗性明顯增強(qiáng)，具有顯著的誘抗作用，說明MeJA在增強(qiáng)甜葉菊抗鏈格孢菌方面起著重要作用。脂氧合酶（lipoxygenase）基因是JA合成通路中的關(guān)鍵基因，當(dāng)植物受到傷誘導(dǎo)時，被激活，誘導(dǎo)JA及MeJA的合成與積累，而生成的JA又可進(jìn)一步激活，促進(jìn)JA的積累[28]，在甜葉菊葉片受鏈格孢菌侵染后，的表達(dá)水平明顯上調(diào)。JAZ蛋白作為E3泛素連接蛋白降解復(fù)合體SCF的靶蛋白，是JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分，其能與茉莉酸信號途徑的轉(zhuǎn)錄因子（如MYC2、MYC3）相結(jié)合從而抑制這些因子的轉(zhuǎn)錄活性，JAZ蛋白是茉莉酸信號途徑重要的負(fù)調(diào)控因子[29]，本研究用鏈格孢菌侵染甜葉菊后，葉片中、的表達(dá)受到抑制，與接種前相比，整體呈下調(diào)表達(dá)的趨勢。JAR1是一種茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）合成酶，被認(rèn)為是擬南芥JA通路中必需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[30]，本研究中甜葉菊響應(yīng)鏈格孢菌的侵染，接種48 h后表達(dá)量顯著上調(diào)，表明在甜葉菊受鏈格孢菌侵染時，JA信號通路基因的表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的改變，提高植物體內(nèi)JA水平，對病原菌的侵染作出響應(yīng)。

4 結(jié)論

根據(jù)真菌形態(tài)鑒定、致病性鑒定以及病原菌rDNA-ITS序列同源性分析結(jié)果，確定甜葉菊褐斑病的致病菌為鏈格孢及細(xì)極鏈格孢。顯微觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)極鏈格孢菌絲可以從葉片的氣孔以及表皮細(xì)胞間隙侵入表皮細(xì)胞。外源施加MeJA能夠有效抑制細(xì)極鏈格孢菌絲的生長，MeJA處理后的甜葉菊葉片對細(xì)極鏈格孢的抗性明顯增強(qiáng)，具有顯著的誘抗作用，在甜葉菊褐斑病的防治中具有很好的應(yīng)用前景。

[1] 劉瓊, 潘蕓蕓, 吳衛(wèi). 甜葉菊化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2018, 30(6): 1085-1091.

LIU Q, PAN Y Y, WU W. Review on chemical compositions and pharmacological activities of(Bertoni) Hemsl., 2018, 30(6): 1085-1091. (in Chinese)

[2] Chaturvedula V S, Clos J F, Rhea J, Milanowski D, Mocek U, DuBois G E, Prakash I. Minor diterpene glycosides from the leaves of., 2011, 4(3): 209-212.

[3] Yadav A K, Singh S, Dhyani D, Ahuja P S. A review on the improvement of stevia [(Bertoni)]., 2011, 91(1): 1-27.

[4] 吳則東, 張文彬, 吳玉梅, 劉乃新. 世界甜葉菊發(fā)展概況. 中國糖料, 2016, 38(4): 62-65.

Wu Z D, Zhang W B, Wu Y M, Liu N X. Review ofdevelopment in the world., 2016, 38(4): 62-65. (in Chinese)

[5] 徐鴻. 甜菊糖的特點(diǎn)及功能. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2013(2): 286-287.

Xu H. Characteristic and functions of stevioside., 2013(2): 286-287. (in Chinese)

[6] 張?zhí)煊? 中國真菌志. 第16卷. 鏈格孢屬. 北京: 科學(xué)出版社, 2003.

Zhang T Y.. Beijing: Science Press, 2003. (in Chinese)

[7] Farr D F, Bills G F, Chamuris G P, Rossman A Y.. St. Paul (Minnesota): The American Phytopathological Society (APS) Press, 1989.

[8] 陳偉群. 鏈格孢及相似屬代表種的分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 1997.

Chen W Q. Molecular phylogenetic study ofand similar genera[D]. Yangling: Northwest A&FUniversity, 1997. (in Chinese)

[9] Tisdale W B, Wadkins R F. Brown spot of tobacco caused by(E. & E.), n. comb., 1931, 21(6): 641-660.

[10] Yu Q. Loss rate estimation of yield and output value of tobacco leaf infected by tobacco blown spot ()., 2010, 1(6): 23-27, 63.

[11] 李金花, 柴兆祥, 王蒂, 李敏權(quán). 甘肅馬鈴薯貯藏期真菌性病害病原菌的分離鑒定. 蘭州大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版), 2007, 43(2): 39-42.

Li J H, Chai Z X, Wang D, Li M Q. Isolation and identification of the pathogens of potato fungus diseases during storage in Gansu Province., 2007, 43(2): 39-42. (in Chinese)

[12] 邵玉琴, 呂佩珂. 番茄早疫病發(fā)生、流行與生態(tài)因子關(guān)系的研究. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版), 1993, 24(2): 208-211.

Shao Y Q, Lü P K. A study about the relationship betweenon the happening prevalence and ecological factors of tomatoes., 1993, 24(2): 208-211. (in Chinese)

[13] Ishiba C, Yokoyama T, Tani T. Black spot disease of stevia caused by., 1982, 48(1): 44-51.

[14] Maiti C K, Sen S, Acharya R, Acharya K. First report ofcausing leaf spot on., 2007, 56(4): 723.

[15] Atghia O, Javan-Nikkhah M, Poursafar A, Khojasteh M, Eslamzadeh B. First report ofspecies as the causal agent of leaf spot onandplants in Iran//. University of Tehran, Karaj, Iran, 2015: 130.

[16] 魏景超. 真菌鑒定手冊. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1979.

Wei J C.. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1979. (in Chinese)

[17] Sun H H, Wang L, Zhang B Q, Ma J H, Hettenhausen C, Cao G Y, Sun J L, Wu J Q, Wu J S. Scopoletin is a phytoalexin againstin wild tobacco dependent on jasmonate signalling., 2014, 65(15): 4305-4315.

[18] Geuns J M C. Stevioside., 2003, 64(5): 913-921.

[19] Philippaert K, Pironet A, Mesuere M, Sones W, Vermeiren L, Kerselaers S, Pinto S, Segal A, Antoine N, Gysemans C, Laureys J, Lemaire K, Gilon P, Cuypers E, Tytgat J, Mathieu C, Schuit F, Rorsman P, Talavera K, Voets T, Vennekens R. Steviol glycosides enhance pancreatic beta-cell function and taste sensation by potentiation of TRPM5 channel activity., 2017, 8: 14733.

[20] Geuns J.. Euprint, 2010.

[21] Geuns J, Struyf T. Radical scavenging activity of steviol glycosides and steviol glucuronide., 2010, 6(8): 2025-2028.

[22] Hajihashemi S, Geuns J M C. Free radical scavenging activity of steviol glycosides, steviol glucuronide, hydroxytyrosol, metformin, aspirin and leaf extract of., 2013, 3(44): S34-S41.

[23] 唐志發(fā). 甜菊糖的崛起與發(fā)展戰(zhàn)略. 中國食品工業(yè), 1999, 6(2): 52.

Tang Z F. The rise and development strategy of stevioside., 1999, 6(2): 52. (in Chinese)

[24] 朱東順, 宋晴晴, 傅在秋, 臧義戰(zhàn). 山東省甜葉菊的主要病害及防治措施. 中國糖料, 2002(3): 27-29.

Zhu D S, Song Q Q, Fu Z Q, Zang Y Z. The diseases and control measures ofin Shandong Province., 2002(3): 27-29. (in Chinese)

[25] 柴再生, 蔣宏, 王亮. 河西走廊甜葉菊拱棚育苗三大病害發(fā)生原因及防治策略. 中國糖料, 2017, 39(4): 79-80.

Chai Z S, Jiang H, Wang L. Causes and prevention strategies of three major diseases in stevia nursery seedlings of Hexi Corridor., 2017, 39(4): 79-80. (in Chinese)

[26] Blée E. Impact of phyto-oxylipins in plant defense., 2002, 7(7): 315-321.

[27] Guo Q, Major I T, Howe G A. Resolution of growth-defense conflict: mechanistic insights from jasmonate signaling., 2018, 44: 72-81.

[28] Grimes H D, Koetje D S, Franceschi V R. Expression, activity, and cellular accumulation of methyl jasmonate-responsive lipoxygenase in soybean seedlings., 1992, 100(1): 433-443.

[29] Chini A, Boter M, Solano R. Plant oxylipins: COI1/JAZs/ MYC2 as the core jasmonic acid-signalling module., 2009, 276(17): 4682-4692.

[30] Mosblech A, Thurow C, Gatz C, Feussner I, Heilmann I. Jasmonic acid perception by COI1 involves inositol polyphosphates in., 2011, 65(6): 949-957.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification of Pathogens Causing Brown Spot and the Role of MeJA in Disease Resistance in

Cui Xiaoxia, Shu Hongmei, Jiang Lu, He Xiaolan, Gong Yuanyong, Ni Wanchao, Guo Shuqiao

(Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014)

【Objective】The objective of this study is to identify the pathogenic fungus causing brown spot disease on, and analyze the role of MeJA in response toto provide a basis for disease prevention and resistance breeding. 【Method】The samples of diseasedleaves were collected from the stevia production base of Fuan Town, Dongtai City, Jiangsu Province. After isolation and purification, the isolates were identified by using the methods of morphological characteristics analysis. Morphology parameters mainly included the colony and conidial morphology, conidial size. The isolates pathogenicity was tested on detachedleaves. The internal transcribed spacer (ITS) rDNA region of the 7 pathogenic strains was amplified by using the fungal universal primers ITS1 and ITS4, and then the amplified product was recovered and sequenced. MEGA 7 was used to construct phylogenetic tree to confirm the pathogen species based on the rDNA-ITS sequence and the relatedsequences in GenBank. The germination status ofconidial spores and the way they invaded the leaves after stained with trypan blue were analyzed by microscopy. The effect on the growth ofmycelium was analyzed by exogenous application of MeJA to potato dextrose agar (PDA) medium. To test the role of MeJA in theresistance to, detached leaves were fed with MeJA and then used for infection. The qPCR method was performed to analyze the expression of JA pathway-related genes before or after inoculation within leaves of. 【Result】Sevenstrains were collected from the diseasedleaves. All the strains grew on the PDA medium in a nearly circular and equal diameter radiation. The aerial hyphae were relatively developed, with white at the beginning and gradually changed to different degrees of grayish black at the later stage. The conidia are solitary or in a chain, mostly nearly spherical, inverted bar-shaped, or inverted pear-shaped, with a size of (20.5-45.5) × (6.5-16.0) μm. The isolated 7 strains were inoculated on the detached leaves of, and the pathogenicity was different. ST2, ST3 and ST7 strains led to the lesions spread rapidly with stronger pathogenicity. The rDNA-ITS sequence length of the ST2, ST3, and ST7 strains was 569, 570, and 570 bp, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that the similarity of ST2 and ST3 with strains KY814634.1 and DQ491089.1 (,sp.) is between 99%-100%, and similarity between ST7 and strain HQ402558.1 () is 99%. The results of trypan blue staining ofleaves inoculated withshowed that conidia of ST7 could germinate from the head, lateral and caudal of the spores, and themycelia could invade into epidermal cells from the stomata or the epidermis intercellular. Exogenous application of MeJA could effectively inhibit the growth ofmycelia when the concentration of MeJA was higher than 200 μmol·L-1. After inoculated with, the lesion area of detached leaves that fed with 100 μmol·L-1MeJA was significantly smaller than that of the control, indicating that MeJA could enhance theresistance to. JA pathway related genes were involved in the response ofto, the expression ofandwas up-regulated while the expression ofandwas down-regulated afterinoculated with.【Conclusion】The pathogenic fungus that causedleaf brown spot in the stevia production base of Fuan Town, Dongtai City, Jiangsu Province was identified as.mycelia can invade epidermal cells from the stomata or the epidermis intercellular space of the leaves. The resistance ofleaves towas enhanced after exogenous application of MeJA, which will become the potential candidates for the control ofbrown spot disease in the field.

; brown spot disease;; identification of pathogens; methyl jasmonate; signaling pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.008

2018-04-18；

2018-05-18

江蘇省科技計劃（SZ-SQ2017019）

崔曉霞，E-mail：cuixiaoxia7@163.com。通信作者郭書巧，Tel：025-84390290；E-mail：gsq925@163.com