張金璧，姚望，潘增祥，劉紅林

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FSH處理對(duì)豬顆粒細(xì)胞中類(lèi)固醇合成酶基因的表達(dá)及其調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾的影響

張金璧，姚望，潘增祥，劉紅林

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095）

【目的】研究FSH處理對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞類(lèi)固醇合成酶、垂體激素受體、凋亡相關(guān)等基因表達(dá)的影響及此過(guò)程中組蛋白H3修飾的變化情況?！痉椒ā渴紫?，采集豬卵巢組織并用注射器抽取方法收集卵泡顆粒細(xì)胞，用含血清體系體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞至貼壁，血清饑餓16h后用終濃度5IU?mL-1的FSH處理24h，并收集細(xì)胞。其次，提取細(xì)胞mRNA，采用qRT-PCR方法檢測(cè)類(lèi)固醇合成酶（STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1）、垂體激素受體（FSHR和LHR）、凋亡相關(guān)基因（XIAP和FasL）mRNA的表達(dá)變化，最后，相同處理后固定細(xì)胞，采用染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合qPCR（ChIP-qPCR）方法檢測(cè)類(lèi)固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾（H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac）狀況?！窘Y(jié)果】5IU?mL-1的FSH處理引起類(lèi)固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B分別為2倍（＜0.01）、2.8倍（＜0.01）和3.6倍（＜0.05）的顯著上調(diào)，而CYP11A1表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化；FSH處理對(duì)垂體激素受體FSHR、LHR和凋亡相關(guān)基因XIAP、FasL影響不顯著。在上調(diào)的三個(gè)類(lèi)固醇合成酶基因中，HSD3B調(diào)控區(qū)組蛋白H3修飾變化最為顯著，H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac結(jié)合分別有14.7倍（＜0.01）、 13.6倍（＜0.01）、19.7（＜0.01）倍和2.5倍（＜0.05）的顯著上調(diào)；STAR基因調(diào)控區(qū)的H3K9ac在處理后有11.1倍的顯著下降（＜0.05）；CYP19A基因調(diào)控區(qū)的H3K4me3和H3K9ac分別有0.5倍的上調(diào)（＜0.01）和10.4倍（＜0.01）的下降，其余組蛋白修飾在處理前后沒(méi)有顯著變化?！窘Y(jié)論】FSH處理24h對(duì)顆粒細(xì)胞類(lèi)固醇合成酶基因轉(zhuǎn)錄有顯著上調(diào)作用，對(duì)其轉(zhuǎn)錄過(guò)程有H3組蛋白修飾參與，組蛋白修飾模式具有基因特異性。垂體激素受體和凋亡相關(guān)基因的應(yīng)答可能需要FSH和其他因素的聯(lián)合作用。

豬；FSH；顆粒細(xì)胞；類(lèi)固醇合成酶；組蛋白修飾

0 引言

【研究意義】組蛋白修飾調(diào)控是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制中的重要組成部分，其靈活快速的調(diào)控特點(diǎn)在細(xì)胞對(duì)微環(huán)境的應(yīng)答過(guò)程中起到了重要作用。在哺乳動(dòng)物基因組中，組蛋白具有多重修飾形式，包括組蛋白末端的乙酰化[1]、甲基化[2]、磷酸化[3]、泛素化[4]、ADP核糖基化[5]等。這些修飾模式多樣，在特定的細(xì)胞和狀態(tài)中對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起到多樣化的調(diào)控作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，能與位于顆粒細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道，對(duì)卵巢卵泡發(fā)育，激素分泌過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)[6-7]外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中，F(xiàn)SH能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡[8]，影響類(lèi)固醇的生成，如促進(jìn)孕酮的合成和分泌以及雌激素合成能力[9]。類(lèi)固醇合成酶是一類(lèi)催化性腺中類(lèi)固醇激素合成的酶類(lèi)，其催化合成的激素包括睪酮、孕酮和雌二醇等[10]。其中類(lèi)固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR，由STAR基因編碼）負(fù)責(zé)將膽固醇由線(xiàn)粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)向線(xiàn)粒體內(nèi)膜運(yùn)送[11]；P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc，由CYP11A1基因編碼）催化膽固醇形成孕烯醇酮[12-13]；隨后在3b-羥甾脫氫酶（3b-HSD，由HSD3B基因編碼）的作用下生成孕酮。孕酮是類(lèi)固醇合成過(guò)程中的基礎(chǔ)甾體，在卵泡膜細(xì)胞中，由C17-20裂解酶（P450c17，由CYP17C編碼）催化生成睪酮[14]。最后在顆粒細(xì)胞中由芳香化酶（P450arom，由CYP19編碼）氧化脫去19-甲基，芳香構(gòu)化轉(zhuǎn)變成C18雌激素（雌酮和雌二醇）[15]。FSH對(duì)垂體激素受體和凋亡相關(guān)基因的誘導(dǎo)具有時(shí)間上和物種間的差異，也與體外培養(yǎng)的條件有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】一般認(rèn)為H3K4的2, 3甲基化可能與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，而聯(lián)合參入的H3K9與 H3K14的乙酰化可能與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，單獨(dú)的H3K14的乙?；瘎t與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)[16-17]。體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞是卵巢研究中常用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究者們對(duì)FSH處理引起的基因應(yīng)答已有一定認(rèn)識(shí)，但組蛋白修飾在這些應(yīng)答中是否參與，如何參與，是否具有特異性等問(wèn)題尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文旨在明確體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞中類(lèi)固醇合成酶基因在FSH處理下的轉(zhuǎn)錄變化情況，并探索這些基因轉(zhuǎn)錄水平變化與其調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的關(guān)系。對(duì)各組蛋白修飾對(duì)FSH的精確應(yīng)答時(shí)間及其在基因調(diào)控區(qū)的詳細(xì)分布狀況進(jìn)行深入研究，繪制組蛋白應(yīng)答的時(shí)空?qǐng)D譜，將進(jìn)一步完善FSH對(duì)顆粒細(xì)胞生理的調(diào)控原理。

1 材料與方法

本研究于2016年9月至2017年2月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)類(lèi)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（國(guó)家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心）完成。

1.1 樣品采集

豬卵巢選自淮安蘇食肉品屠宰點(diǎn)，屠宰后10min內(nèi)采集雙側(cè)卵巢，置于37℃含雙抗（青霉素、鏈霉素各100U?mL-1）的生理鹽水中，3h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

清洗卵巢，用注射器抽取直徑為3—6mm卵泡的卵泡液及顆粒細(xì)胞，800×g離心5min去除卵泡液；PBS清洗顆粒細(xì)胞兩次，800×g離心5min去除PBS后，用完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清和100 U?mL-1雙抗DMEM/F12培養(yǎng)基）重懸細(xì)胞，充分吹打至散開(kāi)并接種于T25培養(yǎng)瓶中；放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)。24h后觀(guān)察顆粒細(xì)胞貼壁情況，棄去培養(yǎng)基及未貼壁的顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞，清洗貼壁的顆粒細(xì)胞，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)傳代；傳代時(shí)用PBS清洗細(xì)胞兩次，加入1mL胰酶消化細(xì)胞，觀(guān)察到大部分細(xì)胞漂起時(shí)即加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，吹打分散細(xì)胞；800×g離心5min，棄去上清，并用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于6孔板中（約105個(gè)/孔）繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 FSH激素處理

正常培養(yǎng)顆粒細(xì)胞48h后，換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)16h，試驗(yàn)組加入5IU/mL的FSH（寧波第二激素廠(chǎng)），對(duì)照組加入同等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用PBS沖洗細(xì)胞兩次，按照Trizol試劑（Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)提取顆粒細(xì)胞RNA（每個(gè)孔用量1mL），紫外比色法測(cè)定總RNA的濃度和純度，用1.4%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。取1μg質(zhì)量合格的總RNA用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）和oligo(dT)18進(jìn)行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）

PBS清洗顆粒細(xì)胞2次，用終濃度1%的甲醛體外交聯(lián)顆粒細(xì)胞，從培養(yǎng)瓶中收集細(xì)胞后，1%SDS裂解液裂解細(xì)胞，超聲波斷裂染色質(zhì)，加特異性抗體（H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac，CST公司）進(jìn)行免疫共沉淀，洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)后，用DNA純化試劑盒（Qiagen公司）進(jìn)行DNA純化，最后以沉淀所得的DNA為模板，進(jìn)行qPCR。

1.6 引物設(shè)計(jì)與qPCR反應(yīng)

定量引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的基因mRNA序列和qPCR反應(yīng)要求，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物；ChIP引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的相應(yīng)基因序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到上游1 000bp以?xún)?nèi)位置，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。全部引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，使用時(shí)用ddH2O稀釋至工作濃度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)依試劑盒（Takara公司）說(shuō)明操作。根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，即ΔCT= CT目標(biāo)基因-CT內(nèi)參基因，目標(biāo)基因的CT 相對(duì)于內(nèi)參基因的CT 為2-ΔCT，轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)的變化表示為對(duì)照的2-ΔCT記為1時(shí)目標(biāo)基因2-ΔCT的相對(duì)值（即2-ΔΔCT），各基因表達(dá)量用均值表示。引物序列信息和擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.1.1 類(lèi)固醇合成酶基因 本試驗(yàn)共檢測(cè)了4個(gè)類(lèi)固醇合成酶基因的表達(dá)水平，分別為STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1。在FSH處理24h后的顆粒細(xì)胞中，STAR、HSD3B和CYP19A1的表達(dá)水平有顯著上升，相比對(duì)照組而言，處理組的表達(dá)水平分別達(dá)到了2倍（＜0.01）、2.8倍（＜0.01）和3.6倍（＜0.05）。而CYP11A1表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化（圖1）。

*. P＜0.05，**. P＜0.01 下同 The same as below

2.1.2 垂體激素受體基因 顆粒細(xì)胞中垂體激素FSH和LH的受體FSHR和LHR的mRNA表達(dá)水平在FSH處理24h后相比對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（圖2）。

2.1.3 凋亡相關(guān)基因 對(duì)抗凋亡基因XIAP和凋亡標(biāo)志基因FasL-2表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證明FSH處理并沒(méi)有顯著改變顆粒細(xì)胞中這兩個(gè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平（圖3）。

2.2 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞類(lèi)固醇合成酶基因調(diào)控區(qū)組蛋白修飾的影響

2.2.1 HSD3B基因的組蛋白修飾變化 在FSH處理24 h后，HSD3B基因上游調(diào)控區(qū)的組蛋白H3修飾發(fā)生了顯著變化（圖4）。其中H3K4me2、H3K4me3、H3K4ac和H3K14ac的結(jié)合水平分別上升了14.7倍（＜0.01）、13.6倍（＜0.01）、19.7（＜0.01）倍和2.5倍（＜0.05），差異均達(dá)到了顯著水平。結(jié)果說(shuō)明HSD3B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與所檢測(cè)的組蛋白修飾關(guān)聯(lián)最為緊密。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

圖2 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞垂體激素受體基因的表達(dá)水平的影響

圖3 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響

圖4 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞HSD3B基因上游調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的影響

2.2.2 STAR、CYP19A基因的組蛋白修飾變化 在FSH處理24h后，STAR基因調(diào)控區(qū)的H3K9ac在處理后有11.1倍的顯著下降（＜0.05, 圖5）；CYP19A基因調(diào)控區(qū)的H3K4me3和H3K9ac分別有0.5倍（＜0.01）的上調(diào)和10.4倍（＜0.01）的下降，其余組蛋白修飾在處理前后沒(méi)有顯著變化（圖6）。結(jié)果說(shuō)明組蛋白修飾具有基因特異性，在不同類(lèi)固醇合成酶基因中的參與有所不同。

圖5 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞STAR基因上游調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的影響

3 討論

3.1 FSH提升類(lèi)固醇合成酶基因表達(dá)水平

FSH在雌性動(dòng)物中能抑制卵泡凋亡、促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)、顆粒細(xì)胞增殖以及類(lèi)固醇激素的合成和分泌[19]。筆者的試驗(yàn)證實(shí)，24h的FSH處理讓卵泡類(lèi)固醇合成3個(gè)主要合成酶基因STAR、HSD3B和CYP19A1的表達(dá)量有了顯著上升。在卵巢類(lèi)固醇激素合成過(guò)程中（圖7），STAR編碼的類(lèi)固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白負(fù)責(zé)類(lèi)固醇“原料”膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，而HSD3B編碼的3b-羥甾脫氫酶是孕酮的主要合成酶，這兩種酶表達(dá)量的升高理論上為進(jìn)一步合成雌激素提供了反應(yīng)底物。而CYP19編碼的芳香化酶是雌激素合成的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平上升與FSH對(duì)顆粒細(xì)胞雌激素合成的影響和對(duì)卵泡健康發(fā)育的維持功能相吻合。同時(shí)，另一個(gè)合成酶基因CYP11A1的表達(dá)量卻沒(méi)有顯著變化，一方面可能由于其編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶及其催化產(chǎn)物孕烯醇酮可能在短期內(nèi)較為充足，不會(huì)限制后續(xù)類(lèi)固醇的合成，另一方面可能由于24h的處理時(shí)間不足讓此基因在表達(dá)水平上產(chǎn)生回應(yīng)。在小鼠和大鼠體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞模型中有研究報(bào)道STAR對(duì)FSH的應(yīng)答極快，3h后既能檢測(cè)到mRNA的上調(diào)，而CYP11A1應(yīng)答較為緩慢，在24h才檢測(cè)到mRNA的表達(dá)變化[20]，這一結(jié)果支持了后一種可能。

3.2 FSH處理對(duì)垂體激素受體的影響

除了類(lèi)固醇合成酶，本研究對(duì)垂體激素受體基因FSHR和LHR的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。在雌性動(dòng)物卵泡中，F(xiàn)SH和雌激素的協(xié)同作用會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞表達(dá)更多FSH及LH受體，增加卵泡對(duì)促性腺激素的敏感性，較高的LH受體水平是大卵泡走向成熟和排卵的關(guān)鍵因素之一。但在體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞中，24h的FSH處理并沒(méi)有導(dǎo)致顯著的FSHR和LHR水平變化。在其他物種的類(lèi)似研究中發(fā)現(xiàn)，48h的FSH處理能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠顆粒細(xì)胞FSHR水平升高[21]， 24h的FSH處理在大鼠顆粒細(xì)胞中引起FSHR顯著升高[22]，在體外培養(yǎng)的羊卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）中，10IU?mL-1濃度的FSH能顯著上調(diào)FSHR和LHR的mRNA水平[23]。然而，在牛顆粒細(xì)胞中，單獨(dú)的FSH處理對(duì)FSHR的mRNA水平?jīng)]有顯著影響，僅有在與5-α-二氫睪丸酮(DHT)聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)才能引起FSHR水平的升高[24]。在LHR對(duì)FSH的應(yīng)答方面，早年有報(bào)道證實(shí)LHR對(duì)FSH的應(yīng)答需要顆粒細(xì)胞和其他類(lèi)型細(xì)胞的協(xié)同配合，因此只有在體內(nèi)、卵泡培養(yǎng)中才能觀(guān)測(cè)到LHR上調(diào)。培養(yǎng)體系中的血清對(duì)LHR的應(yīng)答有較大影響，大鼠無(wú)血清培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中也有LHR上調(diào)的報(bào)道[25]。結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果和他人的研究結(jié)論可見(jiàn)，F(xiàn)SH在豬、牛等動(dòng)物中的作用與在小鼠、大鼠等物種中有所差別，F(xiàn)SH對(duì)垂體激素受體的誘導(dǎo)具有時(shí)間上和物種間的差異，另外也與體外培養(yǎng)的條件有關(guān)。

圖6 FSH處理對(duì)顆粒細(xì)胞CYP19A基因上游調(diào)控區(qū)組蛋白修飾變化的影響

類(lèi)固醇用加粗表示，相應(yīng)合成酶用橢圓表示 Steroid hormones are in bold, steroidogenic enzymes are encircled

3.3 FSH處理對(duì)凋亡相關(guān)基因沒(méi)有顯著影響

對(duì)抗凋亡基因X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）和凋亡標(biāo)志基因FasL-2的表達(dá)水平的檢測(cè)證明FSH處理對(duì)這2個(gè)基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響。在體內(nèi)試驗(yàn)和體外培養(yǎng)的卵泡中均有研究證實(shí)FSH處理能上調(diào)XIAP表達(dá)水平[26-27]，而下調(diào)FasL的表達(dá)水平[28]。但由于體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞模型與完整卵泡相比，在FSH應(yīng)答方面有一定差異，單獨(dú)的FSH處理不足以引起XIAP和FasL-2的轉(zhuǎn)錄變化，但與其他激素，如甲狀腺激素三碘甲狀腺氨酸（T3）的聯(lián)合處理則能誘導(dǎo)這兩個(gè)基因的顯著變化[29]。

3.4 FSH處理對(duì)調(diào)控區(qū)組蛋白修飾的影響具有基因特異性

目前，對(duì)FSH處理的顆粒細(xì)胞模型中組蛋白修飾變化的研究鮮有報(bào)道，卵泡中的組蛋白修飾研究較多集中在黃體化過(guò)程中，在黃體化的大鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)LH的應(yīng)答使STAR和CYP19A1轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，而這些變化與H4ac和H3K4me3修飾顯著相關(guān)[30]。DEBORAH等證實(shí)了全染色質(zhì)水平的H3S10磷酸化在FSH處理24h后有顯著上升[31]。本研究首次在基因水平上對(duì)體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞組蛋白修飾對(duì)FSH處理的反應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果證明組蛋白修飾具有基因特異性。在3個(gè)受FSH調(diào)控上調(diào)的類(lèi)固醇合成酶基因中，HSD3B的調(diào)控區(qū)組蛋白H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac修飾顯著提升，CYP19A1基因調(diào)控區(qū)的H3K4me3修飾也有顯著上升，這些修飾在多數(shù)情況下均與轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)[32]；相反，STAR和CYP19A1基因調(diào)控區(qū)的H3K9ac在處理后有所下降，可見(jiàn)FSH處理對(duì)調(diào)控區(qū)組蛋白修飾的影響具有基因特異性。

4 結(jié)論

FSH處理讓卵泡類(lèi)固醇合成3個(gè)主要合成酶基因STAR、HSD3B和CYP19A1的表達(dá)量有了顯著上升，CYP11A1應(yīng)答較為緩慢。FSH對(duì)垂體激素受體和凋亡相關(guān)基因的誘導(dǎo)具有時(shí)間上和物種間的差異，也與體外培養(yǎng)的條件有關(guān)。對(duì)上游調(diào)控區(qū)組蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)變化與組蛋白修飾有關(guān)，其中HSD3B的表達(dá)增高伴隨著組蛋白H3K4me2、 H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac修飾的顯著提升。本研究為進(jìn)一步完善FSH對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響及調(diào)控機(jī)理提供了參考。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Effects of FSH Treatment on Steroidogenic Enzymes Expression and Histone H3 Modification in Pig Granulosa Cells

ZHANG JinBi, YAO Wang, PAN ZengXiang, LIU HongLin

(College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【Objective】The objective of this study was to explore whether FSH treatment affect expressions of genes including steroidogenic enzymes, pituitary hormone receptors and apoptosis related genes in porcine granulosa cells, and to detect the histone H3 modification on specific gene regulation regions involved in this process. 【Method】 Firstly, ovary granulosa cells were collected using syringe extraction method from porcine ovaries and cultured in media with serum until the cells attached. After 16 h of non-serum culture, granulosa cells were treated by 5 IU?mL-1FSH for another 24 h culture and harvested for following experiment. Secondly, transcriptional expression changes of steroidogenic enzymes (STAR, CYP11A1, HSD3B and CYP19A1), pituitary hormone receptors (FSHR and LHR) and apoptosis related genes (XIAP and FasL) were detected using qRT-PCR method. Finally, histone H3 modification (H3K4me2, H3K4me3, H3K9ac and H3K14ac) status on regulatory regions of STAR, CYP19A1 and HSD3B genes were detected by ChIP-qPCR.【Result】 Treatment of 5 IU?mL-1FSH induced a significant upregulation of STAR, CYP19A1 and HSD3B genes with fold changes of 2 (＜0.01), 2.8 (＜0.0), and 3.6 (＜0.05), respectively, but had no significant effect on CYP11A1, pituitary hormone receptors FSHR, LHR and apoptosis related genes XIAP, FasL. Among the three steroidogenic genes, the histone modifications of HSD3B regulatory region were the most significant. The fold change of H3K4me2, H3K4me3, H3K9ac and H3K14ac was 14.7 (＜0.01), 13.6 (＜0.01), 19.7 (＜0.01) and 2.5 (＜0.05), respectively. H3K9ac on STAR gene regulation region decreased 11.1 (＜0.01) times. H3K4me3 on CYP19A regulation region increased 0.5 (＜0.01) times while H3K9ac decreased 10.4 (＜0.01) times. Other histone modification changes were not significant. 【Conclusion】24 h of FSH treatment enhanced the transcription levels of steroidogenic enzymes in pig granulosa cells. The up-regulation process involved H3 histone modifications in a gene-specific manner. Independent FSH treatment was not capable to induce significant effect on candidate pituitary hormone receptor and apoptosis related genes.

pig; FSH; granulosa cells; steroidogenic enzymes; histone modification

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.014

2017-04-25；

2018-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31630072）、江蘇省自然基金（No. BK20160721 & BK20161453）

張金璧，E-mail：zhangjinbi@njau.edu.cn。通信作者劉紅林，E-mail：liuhonglin@njau.edu.cn