金柳艷，郭寧，石潔，張海劍，劉樹森，張家齊

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黃淮海夏玉米區(qū)玉米籽粒帶菌檢測分析

金柳艷，郭寧，石潔，張海劍，劉樹森，張家齊

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北保定 071000）

【目的】明確黃淮海夏玉米區(qū)玉米籽粒帶菌量,為玉米安全生產(chǎn)、儲藏加工以及檢疫提供參考依據(jù)?！痉椒ā糠謩e于玉米乳熟期及完熟期，采集黃淮海夏玉米區(qū)4個?。ê颖?、河南、山東、安徽）90個市/縣的玉米果穗，每個市/縣采集表面未發(fā)生病癥且果穗飽滿的玉米穗4個，共采集720個樣本。對所有樣本進(jìn)行籽粒外部及內(nèi)部帶菌量及帶菌種類的檢測，外部檢測采用洗滌檢測法，通過統(tǒng)計菌落總數(shù)與稀釋倍數(shù)，計算籽粒表面的孢子負(fù)荷量及分離到的各菌屬的分離比例；內(nèi)部檢測采用PDA平板法，對籽粒外部檢測過的10個籽粒消毒后置于PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計每個籽粒帶菌情況，計算籽粒帶菌率及各菌屬的分離頻率。并且對籽粒內(nèi)部分離頻率較大的菌群進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定?！窘Y(jié)果】供試樣本帶菌量較大，乳熟期籽粒孢子負(fù)荷量在0—1 886個/粒，均值為439個/粒，籽粒帶菌率在0—65.0%，均值為23.6%；完熟期籽粒孢子負(fù)荷量在18—2 658個/粒，均值為942個/粒，籽粒帶菌率在10.0%—100.0%，均值為59.6%。完熟期帶菌量大于乳熟期，但部分地區(qū)乳熟期帶菌量仍較大。不同地區(qū)玉米籽粒帶菌量存在差異，河南省的玉米籽粒帶菌量較大，安徽省帶菌量最少，河北省與山東省居中且差異不明顯。玉米籽粒內(nèi)部以及外部均攜帶的真菌類群有鐮孢菌（spp.）、青霉菌（spp.）、曲霉菌（spp.）、鏈格孢菌（spp.）、木霉菌（spp.）、根霉菌（spp.）、蠕孢菌（-spp.）、毛霉菌（spp.）。乳熟期籽粒外部和內(nèi)部鐮孢菌的分離比例分別為59.1%和36.1%，說明玉米在乳熟期時即有大量鐮孢菌侵入；籽粒外部青霉菌和曲霉菌的分離比例分別為8.9%與0.7%，籽粒內(nèi)部的分離頻率分別為6.0%與1.9%，說明乳熟期青霉菌與曲霉菌也已經(jīng)開始侵染玉米果穗。完熟期籽粒外部與內(nèi)部鐮孢菌的分離比例分別為71.9%和58.5%，籽粒外部青霉菌和曲霉菌的分離比例分別為17.0%和0.9%，籽粒內(nèi)部分離頻率分別為9.3%和2.6%，說明鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌為本研究黃淮海夏玉米區(qū)玉米籽粒攜帶的主要真菌。形態(tài)與分子鑒定結(jié)果顯示，鐮孢菌屬中輪枝鐮孢（）的分離頻率為29.7%，層出鐮孢（）的分離頻率為25.9%，禾谷鐮孢（）的分離頻率為1.3%，表明輪枝鐮孢為優(yōu)勢菌；青霉菌主要分離到繩狀青霉（）和草酸青霉（），分離頻率分別為5.0%和3.6%；曲霉菌主要為黃曲霉（）和黑曲霉（），分離頻率分別為1.4%和1.2%?！窘Y(jié)論】表面無癥狀的玉米籽粒在乳熟期及完熟期均攜帶大量病原菌，且完熟期帶菌量大于乳熟期；鐮孢菌在黃淮海夏玉米區(qū)的分離頻率最大，輪枝鐮孢為當(dāng)?shù)赜衩鬃蚜y帶的優(yōu)勢真菌。

玉米籽粒；真菌檢測；分離頻率；黃淮海夏玉米區(qū)

0 引言

【研究意義】玉米是我國重要的糧食作物、飼料來源及輕工業(yè)加工原料，在國民經(jīng)濟(jì)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。玉米果穗在田間生長過程中會遭遇病原真菌的侵染，造成部分果穗發(fā)生穗腐病，表現(xiàn)為籽粒、穗軸或整個果穗霉變，使發(fā)病籽粒攜帶大量病原菌[1-4]。發(fā)病籽粒收獲后，由于含水量較高或貯藏不當(dāng)?shù)仍?，容易造成周圍籽粒腐爛，導(dǎo)致玉米品質(zhì)劣變[5-6]。不僅如此，病原真菌在生長代謝過程中還會產(chǎn)生伏馬毒素、黃曲霉毒素等多種霉菌毒素，造成食用者中毒[7]。而且玉米籽粒作為主要的飼料來源，真菌污染導(dǎo)致飼料適口性及營養(yǎng)價值降低，牲畜中毒或死亡，也會造成水產(chǎn)品、乳及乳制品、肉類等農(nóng)副產(chǎn)品連鎖性污染[8-12]，據(jù)美國食品和藥物管理局的調(diào)查表明，全球25%的飼料及飼料原料受到真菌毒素的污染[13]。有些果穗或籽粒表面無明顯病害癥狀，但這并不代表其不攜帶病菌。由于玉米的營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，同時其胚芽大、吸濕性較強，若晾曬不徹底或貯藏環(huán)境濕度較大，當(dāng)溫度合適時，也可能會引起籽粒表面或內(nèi)部潛藏真菌快速、大量繁殖，引起周圍籽粒發(fā)生霉變。因此，檢測玉米籽粒帶菌量及病菌種類并提出預(yù)防措施，對玉米安全生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】真菌毒素是產(chǎn)毒真菌的次級代謝產(chǎn)物，許多研究將關(guān)注點放在真菌毒素，從而忽視了對真菌的研究，真菌與真菌毒素并非一一對應(yīng)，一種真菌可產(chǎn)生多種真菌毒素，一種毒素也可能由多種真菌產(chǎn)生，因此不能從毒素推測真菌種類。真菌侵染不僅發(fā)生在玉米的開花、結(jié)果、成熟、收獲過程中，也發(fā)生在玉米籽粒晾曬、收購、加工、貯藏、運輸?shù)冗^程[14]。國內(nèi)外對完熟期與貯藏期玉米籽粒帶菌檢測的研究較多，對收獲前期籽粒帶菌檢測的研究較少。Mannaa等[15-16]對收獲前后有害真菌和真菌毒素的危害以及控制策略進(jìn)行了綜述，并對收獲前期、收獲時、貯藏期真菌群落的種類進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)玉米籽粒在不同階段攜帶真菌群落種類以及數(shù)量會發(fā)生改變；Lacey[17]研究發(fā)現(xiàn)，玉米果穗于吐絲期開始就會受到真菌感染，乳熟期以后若蟲害發(fā)生會加重感染，且收獲前和收獲后鐮孢菌與黃曲霉對玉米果穗危害較大。許多研究表明，鐮孢菌（spp.）為玉米穗腐病的主要致病菌，同時也是玉米種子或籽粒攜帶的優(yōu)勢菌群[18-22]。Marco等[7]對墨西哥27個貯藏期玉米樣本進(jìn)行帶菌檢測，發(fā)現(xiàn)鐮孢菌的分離比例較大，為32%；曲曉麗等[18]對從農(nóng)戶收集的88份玉米籽粒進(jìn)行帶菌檢測，發(fā)現(xiàn)鐮孢菌為優(yōu)勢菌屬，同時青霉菌（spp.）、曲霉菌（spp.）、黑孢菌（spp.）、木霉菌（spp.）的分離頻率亦較高；郭聰聰?shù)萚19]采集2011—2012年間甘肅省5個地區(qū)的225 份玉米籽粒樣本進(jìn)行了鐮孢菌的分離、鑒定，共分離出516株鐮孢菌，其中輪枝鐮孢（）為優(yōu)勢病原菌。我國對玉米種子帶菌檢測的研究較多，馬奇樣等[23]對500粒種子洗滌檢查發(fā)現(xiàn)，寄藏于種子的真菌孢子數(shù)量大，分布普遍；羅曉楊等[20]采用平板培養(yǎng)法、冷凍濾紙法對24份玉米生產(chǎn)品種進(jìn)行了種子帶菌檢測，結(jié)果表明玉米種子主要攜帶鐮孢菌，其次為曲霉菌和青霉菌?！颈狙芯壳腥朦c】玉米在生長過程中果穗會遭遇大量病原菌的侵染而發(fā)生穗腐病，但是未出現(xiàn)病癥的籽粒表面及內(nèi)部攜帶病原菌的種類以及數(shù)量還未見報道。迄今為止，我國對農(nóng)作物真菌污染的研究主要是取作物收獲后或貯藏期的籽粒作為樣本，缺少對于收獲前真菌檢測的研究，且取樣并非表面完全無病癥的籽粒?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對黃淮海夏玉米區(qū)乳熟期及完熟期的表面無病癥籽粒進(jìn)行帶菌檢測，明確玉米籽粒在不同熟期的帶菌情況，為玉米安全生產(chǎn)、貯藏、加工與檢疫提供依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為筆者實驗室2017年采集的黃淮海夏玉米區(qū)玉米穗樣本，分別于玉米乳熟期、完熟期在河北省（29個）、河南?。?6個）、山東?。?7個）、安徽省（8個）4個省共90個市/縣進(jìn)行采樣。品種為鄭單958，每個地區(qū)選擇無明顯病蟲害發(fā)生的地塊，每個地塊去除4行邊行，中間區(qū)域每隔10 m采集1個未發(fā)生病蟲害、果穗飽滿的玉米穗，每個地區(qū)分別于乳熟期和完熟期各取4個果穗，共計720個果穗樣本。具體采樣時間見表1。

表1 采樣地區(qū)與時間

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與保存 取樣時連同苞葉一起取下，用滅菌后的吸水紙包裹嚴(yán)實，乳熟期果穗由于含水量較高，取下后置于裝有冰袋的泡沫盒內(nèi)，以便運輸途中保存。成熟期果穗含水量較低，直接用滅菌后的吸水紙包好后置于泡沫盒中保存運輸。

1.2.2 籽粒外部帶菌種類及帶菌量檢測 帶菌檢測時需要對每個市/縣采集的乳熟期與完熟期的各4個果穗進(jìn)行檢測，將每個玉米穗全部脫粒，籽粒充分混勻后從中隨機取10粒置于50 mL離心管中，加入10 mL滅菌水，用斡旋振蕩器充分振蕩10 min，2 000 r/min 離心10 min，倒去上清液，加5 mL無菌水均勻懸浮后取出適當(dāng)體積用無菌水進(jìn)行系列梯度稀釋，稀釋梯度分別為10、50、100倍，每個稀釋梯度菌懸液吸取100 μL均勻涂抹到直徑9 cm的PDA平板上（PDA中加適量乳酸抑制細(xì)菌），20℃恒溫箱中黑暗條件下培養(yǎng)觀察，5 d后觀察平板上的菌落，根據(jù)菌落的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參考文獻(xiàn)[24-25]對孢子進(jìn)行識別與鑒定，根據(jù)菌落總數(shù)和稀釋倍數(shù)計算孢子負(fù)荷量以及各菌屬的分離比例。

孢子負(fù)荷量（個/粒）=菌落總數(shù)×稀釋倍數(shù)/10粒

某類菌分離比例（%）=（某類真菌菌落個數(shù)/菌落總數(shù)）×100

1.2.3 籽粒內(nèi)部帶菌種類及帶菌量檢測 籽粒內(nèi)部帶菌檢測采用美國國家種子健康體系（national seed health system，NSHS）建議的PDA平板法[26]，每個玉米穗檢測10粒。將籽粒外部檢測時的10個玉米籽粒置于2%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，用無菌水沖洗3次，置于滅菌濾紙上，于超凈臺中吹干表面游離水；然后將籽粒均勻擺放在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒；26℃恒溫箱中12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)，5 d后鏡檢，計算籽粒帶菌率以及分離到的各菌屬的分離頻率。

籽粒帶菌率（%）=（帶菌籽粒數(shù)/檢測籽粒總數(shù)）×100

某類菌分離頻率（%）=（帶某類菌籽粒數(shù)/帶菌籽?？倲?shù)）×100

1.2.4 病原菌鑒定 將內(nèi)部檢測分離到的真菌轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，根據(jù)病原菌的菌落形態(tài)，以及分生孢子的有無、大小、形態(tài)等特征對分離到的病原菌進(jìn)行初步鑒定[24-25]。提取病原菌基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為通用引物ITS1（TC CGTAGGTGAACCTGCGG）與ITS4（TCCTCCGCTT ATTGATATGC）、EF1（ATGGGTAAGGARGACAAG AC）與EF2（GGARGTACCAGTSATCATGTT），PCR反應(yīng)體系：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的上游引物和下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s（退火溫度視引物而定），72℃延伸45 s，共38個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理。將不同地區(qū)計算得來的所有果穗樣本的孢子負(fù)荷量和籽粒帶菌率以及檢測分離到的各真菌的分離頻率進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，并計算不同地區(qū)各時期4個果穗檢測結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)玉米籽粒的帶菌量

對黃淮海夏玉米區(qū)玉米籽粒內(nèi)部及外部帶菌量進(jìn)行統(tǒng)計分析，圖1為籽粒內(nèi)部及外部帶菌檢測結(jié)果。每個地區(qū)取4個果穗籽粒帶菌率及孢子負(fù)荷量的平均值（表2），結(jié)果顯示，試驗樣本籽粒帶菌量均較大，不同地區(qū)采集的乳熟期籽粒的孢子負(fù)荷量在0—1 886個/粒，均值為439個/粒；籽粒帶菌率在0—65.0%，均值為23.6%；不同地區(qū)采集的完熟期籽粒的孢子負(fù)荷量在18—2 658個/粒，均值為942個/粒；籽粒帶菌率在10.0%—100.0%，均值為59.6%。乳熟期與完熟期的籽粒帶菌率與孢子負(fù)荷量差異均較大，檢測的90個地區(qū)中，86個地區(qū)完熟期籽粒的孢子負(fù)荷量大于乳熟期籽粒的孢子負(fù)荷量，87個地區(qū)完熟期籽粒帶菌率大于乳熟期籽粒帶菌率。

同一地區(qū)的籽粒帶菌率與孢子負(fù)荷量并未發(fā)現(xiàn)具有明顯的相關(guān)性，以完熟期為例，安徽省蚌埠玉米籽粒帶菌率僅為10.0%，而孢子負(fù)荷量卻高達(dá)1 458個/粒；河南省新鄭玉米籽粒帶菌率為100.0%，籽粒表面的孢子負(fù)荷量僅為275個/粒。

不同省份和地區(qū)的玉米籽粒帶菌情況不同。以完熟期為例，河南省睢陽市、新鄭市玉米籽粒的帶菌率達(dá)100.0%，山東省諸城、河北省灤平玉米籽粒的帶菌率分別為92.3%和87.5%，而安徽省蚌埠、河南省商丘、山東省鄆城、河北省新樂的籽粒帶菌率較少，分別為10.0%、42.5%、20.0%和37.5%；河南省襄縣、山東省莒縣和河北省涿州市玉米籽粒的孢子負(fù)荷量分別為2 658、2 228和2 160個/粒，河南省淮陽、山東省臨沂市和河北省武強縣完熟期玉米籽粒的孢子負(fù)荷量較少，分別為18、350和33個/粒。不同省份總體帶菌量也有差異，4個省份中乳熟期及完熟期孢子負(fù)荷量由大到小依次為河南、山東、河北、安徽。4個省份乳熟期籽粒帶菌率由大到小依次為河南、山東、河北、安徽，完熟期籽粒帶菌率由大到小依次為河南、河北、山東、安徽。

2.2 玉米籽粒攜帶病原菌的種類

2.2.1 玉米籽粒外部攜帶病原菌的種類 經(jīng)檢測玉米籽粒外部主要攜帶真菌有鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌、鏈格孢菌（spp.）、木霉菌、根霉菌（spp.）、毛霉菌（spp.）、蠕孢菌（-spp.）等；鐮孢菌的分離比例最大，其次是青霉菌，再次為曲霉菌。不同省份孢子負(fù)荷量及外部攜帶鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌的分離比例見表3。乳熟期鐮孢菌的分離比例在53.7%—62.6%，均值為59.1%，青霉菌和曲霉菌的分離比例較小，分別在6.5%—13.8%與0—1.9%，均值分別為8.9%與0.7%。完熟期籽粒外部鐮孢菌分離比例最大，在58.7%—83.3%，均值為71.9%；青霉菌分離比例次之，在11.6%—22.9%，均值為17.0%；曲霉菌分離比例在0.2%—2.2%，均值為0.9%。4個省份中，山東省鐮孢菌所占分離比例最大，為83.3%，曲霉菌分離比例偏大，為2.2%。

表2 不同地區(qū)籽粒帶菌結(jié)果

A—C：玉米籽粒外部帶菌檢測圖片The external detection of maize grains；D—F：玉米籽粒內(nèi)部帶菌檢測圖片The internal detection of maize grains

表3 不同省份玉米籽粒外部攜帶主要真菌的分離比例

2.2.2 玉米籽粒內(nèi)部主要病菌類群的種類鑒定及出現(xiàn)頻率 通過對360份完熟期玉米穗樣本內(nèi)部帶菌檢測，發(fā)現(xiàn)鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌的分離頻率較大，對其進(jìn)行純化培養(yǎng)，并經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定病原菌種類及分離頻率（表4），發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌屬為鐮孢菌屬，主要分離到輪枝鐮孢、層出鐮孢（）、禾谷鐮孢（），其中輪枝鐮孢所占分離頻率最高，平均分離頻率為29.7%，層出鐮孢次之，平均分離頻率為25.9%，禾谷鐮孢分離頻率較低，平均分離頻率僅1.3%。青霉菌主要為繩狀青霉（）和草酸青霉（），分離頻率分別為5.0%和3.6%，除安徽省外，其余3省草酸青霉分離頻率均大于繩狀青霉，安徽省未分離到草酸青霉，僅分離到繩狀青霉。曲霉菌主要為黃曲霉（）和黑曲霉（），分離頻率分別為1.4%和1.2%。黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素具有致癌性，河北省黃曲霉的分離比例最低，為0.6%，安徽省黃曲霉的分離比例較高，為2.0%。除鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌外，還檢測到其他真菌，包括非洲哈茨木霉（）、鏈格孢（）、玉米生離蠕孢菌（）、稻黑孢霉（）、緊密帚枝霉（）等。

表4 不同省份玉米籽粒內(nèi)部分離病原菌種類及分離頻率

2.2.3 玉米籽粒內(nèi)部主要病原菌的分離頻率 經(jīng)檢測玉米籽粒內(nèi)部主要攜帶真菌有鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌、鏈格孢菌、木霉菌、根霉菌、稻黑孢菌、帚枝霉菌、毛霉菌、蠕孢菌等。不同省份籽粒帶菌率及內(nèi)部攜帶鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌的分離頻率見表5。結(jié)果顯示鐮孢菌的分離頻率最大，青霉菌次之，曲霉菌最低，與籽粒外部帶菌種類檢測結(jié)果一致。乳熟期鐮孢菌的分離頻率在25.2%—43.7%，完熟期鐮孢菌的分離頻率在49.2%—65.2%，其中山東省完熟期鐮孢菌的分離頻率最大，為65.2%；乳熟期青霉菌的分離頻率在4.0%—8.9%，完熟期青霉菌分離頻率在7.6%—11.8%，安徽省完熟期青霉菌分離頻率最大，為11.8%；曲霉菌在乳熟期與完熟期的分離頻率分別在1.3%—3.1%與2.0%—3.1%，河北省乳熟期曲霉菌分離頻率最大，為3.1%。

3 討論

通過對黃淮海夏玉米區(qū)90個市/縣采集的玉米果穗進(jìn)行帶菌檢測，結(jié)果表明不同熟期表面無癥狀籽粒均攜帶大量病原真菌，主要與病原菌的潛伏性有關(guān)。

表5 不同省份玉米籽粒內(nèi)部攜帶主要真菌的分離頻率

穗腐病是造成玉米籽粒帶菌的主要原因，穗部蟲害可加重穗腐病的發(fā)生，是造成病原菌侵染的重要因素[27-28]，穗腐病是玉米生長后期發(fā)生的重要病害，由于在玉米生長后期，果穗迅速脫水，苞葉開始松散，病穗上、空氣中的真菌孢子可通過氣流傳播到其他果穗的籽粒表面，因此，表面無癥狀的果穗上也可能攜帶大量病原菌。在玉米脫粒過程中，發(fā)生穗腐病的籽?？赡軙蝗コＳ嗟臒o癥狀籽粒會被進(jìn)一步加工成飼料等加工品，直接影響人畜安全。因此應(yīng)加強對玉米籽粒真菌生長的細(xì)致性檢測與鑒定，加強對玉米的儲存方式、溫度和濕度等因素良好的控制。

玉米乳熟期是籽粒中各種營養(yǎng)物質(zhì)迅速積累的時期，試驗發(fā)現(xiàn)，乳熟期玉米籽粒仍有較高的帶菌率。河北涿州、河南洛陽、平頂山、鄧州、山東萊陽、濟(jì)寧、安徽蒙城地區(qū)乳熟期孢子負(fù)荷量均大于1 200個/粒；河北無極、河南夏邑、太康、鄧州、原陽、輝縣；山東濟(jì)陽、齊河乳熟期籽粒帶菌率在50%以上。其中河南鄧州不僅孢子負(fù)荷量較大（1 632個/粒），籽粒帶菌率也較高（65%），表明病原菌在乳熟期之前就已經(jīng)侵入，因此穗腐病防治需提前到抽雄吐絲期。在玉米吐絲期可用65%代森錳鋅可濕性粉劑400—500倍液噴果穗，預(yù)防病原菌的入侵[29]。完熟期籽粒帶菌量大于乳熟期，主要是因為玉米主要病害大多發(fā)生在生長后期，尤其玉米穗腐病在灌漿期開始發(fā)生，乳熟期至蠟熟期表現(xiàn)癥狀，且多從果穗頂端開始蔓延，逐漸向下侵染[4]。黃淮海地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，降雨集中在每年的6—8月份，此時正值夏玉米生長季節(jié)，適宜大多真菌的生長，很容易發(fā)生穗腐病，隨著果穗慢慢成熟，霉菌的數(shù)量會逐漸增加，因此完熟期的玉米籽粒帶菌量高于乳熟期。

本研究還發(fā)現(xiàn)，玉米籽粒內(nèi)部和外部均攜帶的真菌種類包括鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌、鏈格孢菌、木霉菌、根霉菌、蠕孢菌、毛霉菌，其中鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌為分離獲得的主要真菌。胡曉芬等[21]采用洗滌檢測法對7個玉米品種進(jìn)行了種子表面帶菌檢測，與本研究所用方法一致，結(jié)果表明供試種子表面攜帶的真菌主要為青霉菌、根霉菌、鐮孢菌和鏈格孢菌，與本研究分離到的真菌種類部分重疊；蔣孟多等[22]采用濾紙培養(yǎng)基法和PDA培養(yǎng)基法同樣對這7個玉米品種進(jìn)行種子內(nèi)部帶菌檢測，發(fā)現(xiàn)濾紙培養(yǎng)基法在檢測過程中由于只有溫度和光照條件，導(dǎo)致帶菌種類單一，不能準(zhǔn)確反應(yīng)種子帶菌情況；采用PDA培養(yǎng)基法，培養(yǎng)5—7 d均出現(xiàn)帶菌情況，且?guī)ЬN類和帶菌量各不相同，因此采用PDA培養(yǎng)基法檢測種子內(nèi)部帶菌較好。

分子鑒定研究發(fā)現(xiàn)，鐮孢菌屬中輪枝鐮孢為優(yōu)勢菌株，與前人[16,30-32]鑒定結(jié)果一致，禾谷鐮孢也是引起玉米穗腐病的優(yōu)勢病原菌之一[33]，但本研究中禾谷鐮孢的分離比例僅為1.3%。輪枝鐮孢在玉米上引起的穗腐病主要以粒腐為主，表面危害較小，但對于表面無病癥但是帶菌量較大的籽粒的危害不容忽視，在后續(xù)貯藏工作中，遇到適宜的條件仍可能會發(fā)生霉變，產(chǎn)生伏馬毒素，伏馬毒素是一種霉菌毒素，是由輪枝鐮孢產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[34]。青霉菌的分離比例次之，青霉菌產(chǎn)生的展青霉素、桔青霉素、黃綠青霉素、紅色青霉毒素等對玉米飼料安全存在威脅。曲霉菌的分離比例最小，但是其產(chǎn)生的黃曲霉毒素具有強烈的致癌、致畸和致突變作用，其毒性是砒霜的68倍，是氰化鉀的10倍[35-36]，黃曲霉毒素污染較為普遍[37-39]。

為了預(yù)防玉米籽粒真菌毒素污染，通過培育和種植抗病品種是解決毒素污染最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。此外通過農(nóng)藝措施如種植密度不宜過大，保證田間的通風(fēng)透氣，并且可以通過合理灌溉增加土壤濕度，最好在收獲前3—5周內(nèi)適當(dāng)灌溉，避免遭受干旱脅迫，降低收獲前真菌污染。同時應(yīng)盡量避免由于玉米貯藏不當(dāng)導(dǎo)致的帶菌率高的現(xiàn)象，由于就地貯藏是玉米貯藏普遍采用的一種方法，玉米果穗堆積在一起，較長的一段時間內(nèi)處于非通風(fēng)狀態(tài)，受污染或殘留的霉菌會重新繁殖。因此玉米在收獲后要進(jìn)行充分晾曬，使玉米含水量不超過13%，并采用科學(xué)的方法安全貯藏。

4 結(jié)論

黃淮海夏玉米區(qū)玉米籽粒內(nèi)外帶菌量完熟期大于乳熟期，玉米籽粒在乳熟期仍有一定的帶菌量，完熟期籽粒帶菌量較大。玉米籽粒內(nèi)部以及外部均攜帶的真菌有鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌、鏈格孢菌、木霉菌、根霉菌、蠕孢菌、毛霉菌，其中鐮孢菌、青霉菌、曲霉菌為分離獲得的主要真菌，鐮孢菌屬中輪枝鐮孢為優(yōu)勢菌，青霉菌屬中繩狀青霉和草酸青霉為優(yōu)勢菌，曲霉菌主要為黑曲霉與黃曲霉。不同地區(qū)籽粒帶菌量不同，河南省的玉米籽粒帶菌量較大，安徽省帶菌量最小，其余兩省差異不明顯。

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（（責(zé)任編輯 岳梅）

Detection and Analysis of Fungi Carried by Maize Grain in Huang-Huai-Hai Summer Maize Region

JIN Liuyan, GUO Ning, Shi Jie, ZHANG Haijian, LIU Shusen, ZHANG Jiaqi

(Plant Protection Institute, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to determine the amount of fungi carried in maize grains in Huang-Huai- Hai summer maizeregion, and to provide reference for safe production, storage, processing and quarantine of maize.【Method】A total of 720 maize ears were collected at the stages of milk-ripening and full-ripening in 90 cities or counties in 4 provinces (Hebei, Henan, Shandong, Anhui) of the Huang-Huai-Hai summer maize region, 4 full maize ears with no symptom on the surface were sampled in each city or county. All samples were tested for the amount and species of fungi carried, including external and internal tests of maize grains. Washing detection method was used to calculate the spores load on the grain surface, the spore load on the grain surface and isolation rate of each genus were calculated by counting the total number of colonies and dilution multiple. The PDA plate method was used for internal detection. Ten grains tested externally were sterilized and cultured on PDA plate. The fungi carrying rate of grains and the isolation frequency of each genus of fungi were calculated by counting the fungi carrying rate of each grain. In addition, the morphological and molecular identification of the higher frequency fungi were carried out. 【Result】The samples carried a large number of fungi. the spores load of the tested samples ranged from 0 to 1 886 per grain, with an average of 439 spores per grain at milk-ripening stage, the fungi-carrying rate of grains ranged from 0 to 65.0%, with an average of 23.6%. The spores load ranged from 18 to 2 658 per grain, with an average of 942 spores per grain at full-ripening stage, the fungi-carrying rate of grains ranged from 10.0% to 100.0%, with an average of 59.6%. The amount of fungi carried in full-ripening stage was higher than that in milk-ripening stage, but in some areas, the amount of fungi carried was still large in milk-ripening stage. There were differences in the amount of fungi carried in maize grains in different areas. The amount of fungi carried in maize grains in Henan Province was the largest, and Anhui Province had the least amount of fungi, Hebei Province and Shandong Province were in the middle and the difference was not significant. Fungal communities carried both inside and outside of maize grains includedspp.,spp.,spp,spp.,spp.,spp.,-spp.,spp. The isolation rate ofspp. in the grain external and internal detection was 59.1% and 36.1% respectively at milk-ripening stage, indicating that a large number ofspp. occurred at milk-ripening stage of maize. The isolation rate ofspp. andspp. in external grains was 8.9% and 0.7% respectively, and the isolation frequency in internal grains was 6.0% and 1.9% respectively, indicating thatspp. andspp. had begun to infect maize ear at milk-ripening stage. The isolation rate ofspp. in the grain external and internal detection was 71.9% and 58.5% respectively at full-ripening stage, the isolation rate ofspp. andspp. in external grains was 17.0% and 0.9% respectively, and the isolation frequency in internal grains was 9.3% and 2.6% respectively, indicating thatspp.,spp. andspp.were the main fungi carried by maize grains in Huang-huai-hai summer maize region. Morphological and molecular identification results showed thatwas the dominant strain inspp., the isolation frequency of,,was 29.7%, 25.9%, 1.3%, respectively.andwere the dominant strains inspp., and the isolation frequency was 5.0% and 3.6%, respectively.andwere the dominant strains inspp.,and the isolation frequency was 1.4% and 1.2%, respectively. 【Conclusion】the maize grains with no surface symptom carried a large number of fungi in both milk-ripening and full-ripening stages, and the amount of fungi carried in the full-ripening stage is higher than that in the milk-ripening stage.spp. is the most frequently isolated fungi in Huang-huai-hai summer maize region andis the dominant strain. It is the dominant pathogen carried by local maize grains.

maize grain; fungi detection; isolation frequency; Huang-huai-hai summer maize region

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.18.007

2018-04-21；

2018-06-25

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（玉米）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）

金柳艷，E-mail：jinliuyan216@163.com。通信作者石潔，E-mail：shij99@163.com