葉珍潔，胡盈瑩

(福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)室，福建 福州 350002)

兩性霉素B是廣譜抗真菌藥，主要通過(guò)與敏感真菌細(xì)胞膜上的甾醇結(jié)合，損傷膜的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外漏而發(fā)揮抗真菌作用[1]。近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物的廣泛應(yīng)用，深部真菌感染的發(fā)生率不斷升高。兩性霉素B為臨床上抗深部真菌感染的一線(xiàn)用藥，抗真菌譜廣，抗菌作用強(qiáng)，然而，該藥引發(fā)腎損傷的發(fā)生率高，其腎毒性大多與藥物蓄積相關(guān)[2]，劑量較大時(shí)可導(dǎo)致不可逆的急性腎衰竭[3-4]。臨床上可對(duì)重癥真菌感染、腎功能不全及兒童患者[5]等進(jìn)行兩性霉素B血藥濃度監(jiān)測(cè)并根據(jù)結(jié)果及時(shí)調(diào)整藥物劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，可提高藥物療效并減少對(duì)肝、腎等的毒性。本研究建立了快速、簡(jiǎn)便、專(zhuān)屬性強(qiáng)且重現(xiàn)性好的兩性霉素B高效液相色譜檢驗(yàn)法，可用于兩性霉素B的血藥濃度監(jiān)測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(G1311C四元泵、G1329B進(jìn)樣器、G1316A可調(diào)柱溫恒溫箱及G1314F紫外檢測(cè)器)購(gòu)自Agilent公司；BSA224S-CW型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Legend Micro21R型高速離心機(jī)(Thermo公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 Basic型渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)。

1.2 藥品與試劑

兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，批號(hào)：C10243050)；磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140102，分析純)；冰乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：A116174，色譜純)；三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：T103287，色譜純)；乙腈(德國(guó)默克公司，色譜純)；水為重蒸去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglilent C18反向色譜柱(LiChrosorb 100 RP-18，200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L KH2PO4溶液(1%三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0)(V∶V=60∶40)；柱溫：25 ℃；流速：1 ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：410 nm；進(jìn)樣量：100 μl。

2.2 樣品的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、標(biāo)準(zhǔn)品工作液及質(zhì)控樣品工作液：精密稱(chēng)取兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于1.5 ml Eppendorf管(EP管)中，取二甲基亞砜1 ml完全溶解，后將該溶解液移至100 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用乙腈分別稀釋為60.0、30.0、20.0、10.0、5.0、2.5及0.5 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，避光儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用乙腈稀釋為50.0、12.5及1.25 μg/ml的質(zhì)控樣品工作液，避光儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。

2.2.2 血漿樣品前處理：取待測(cè)血樣[第5劑給藥前0.5 h收集的血漿樣品，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝]1.5～2.0 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清血漿400 μl，加入乙腈沉淀蛋白400 μl，渦旋振蕩5 s，靜置5 min待蛋白完全沉淀后，在13 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，濾液置于1.5 ml EP管中待測(cè)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取空白血漿400 μl置于1.5 ml EP管中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行蛋白沉淀并過(guò)濾待測(cè)；取空白血漿320 μl置于1.5 ml EP管，加入12.5 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品80 μl，即得兩性霉素B質(zhì)量濃度為2.5 μg/ml的血漿溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行蛋白沉淀并過(guò)濾待測(cè)；取待測(cè)血漿400 μl，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行蛋白沉淀并過(guò)濾。3個(gè)樣品按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1，兩性霉素B的出峰時(shí)間約為5.5 min。結(jié)果表明，空白血漿內(nèi)源物質(zhì)不干擾兩性霉素B的測(cè)定，本方法具有較高的專(zhuān)屬性。

A.空白血漿；B.空白血漿+兩性霉素B(2.5 μg/ml)；C.待測(cè)血漿A. blank plasma; B. blank plasma + AmB(2.5 μg/ml); C. plasma to be tested圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及定量下限的測(cè)定：取空白血漿320 μl置于1.5 ml EP管中，加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液80 μl分別得12.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5及0.1 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法預(yù)處理后，依次進(jìn)樣測(cè)定[6]。以樣品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=264.54X-6.358 6，r=0.999 8。兩性霉素B血藥濃度在0.1～12.0 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。兩性霉素B血漿樣品的定量下限為0.1 μg/ml，平行對(duì)5個(gè)質(zhì)量濃度為0.1 μg/ml 兩性霉素B的血漿樣品進(jìn)行測(cè)定，平均回收率為98.23%，準(zhǔn)確度良好，RSD=5.64%<20%，精密度良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)：用空白血漿配制低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)3個(gè)血藥濃度的兩性霉素B血漿溶液，日內(nèi)連續(xù)測(cè)3次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度[6]。低、中及高濃度的日內(nèi)及日間精密度的RSD均<15%，精密度良好，見(jiàn)表1。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：用空白血漿配制低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)3個(gè)血藥濃度的兩性霉素B血漿溶液，分為3組，分別測(cè)定室溫(25 ℃)避光放置2、4 h，-20 ℃凍存1、3 d，凍融1次和3次的穩(wěn)定性[6]。結(jié)果顯示，低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)血藥濃度兩性霉素在3種條件下測(cè)定結(jié)果與標(biāo)示濃度比較，RSD均<15%，方法穩(wěn)定性良好，見(jiàn)表2。

表1兩性霉素B日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab1Inter-dayandintra-dayprecisiontestofamphotericinB

濃度/(μg/ml)日內(nèi)精密度(n=5)日間精密度(n=5)實(shí)測(cè)濃度/(μg/ml)RSD/%實(shí)測(cè)濃度/(μg/ml)RSD/%0.250.242±0.0125.110.243±0.0114.752.52.43±0.031.372.45±0.052.0010.09.70±0.121.239.80±0.151.53

表2不同質(zhì)量濃度兩性霉素B的穩(wěn)定性結(jié)果
Tab2StabilityofdifferentconcentrationsofamphotericinB

實(shí)驗(yàn)條件時(shí)間0.25 μg/ml2.5 μg/ml10.0 μg/ml實(shí)測(cè)濃度/(μg/ml)RSD/%實(shí)測(cè)濃度/(μg/ml)RSD/%實(shí)測(cè)濃度/(μg/ml)RSD/%室溫避光2 h0.232.232.391.139.341.634 h0.223.222.322.349.061.78血漿冰凍1 d0.242.532.431.329.671.653 d0.232.342.411.519.521.98血漿凍融1次0.242.252.441.329.611.153次0.243.682.461.379.771.32

2.3.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)：用空白血漿配制低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)3個(gè)血藥濃度的兩性霉素B血漿溶液，每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算準(zhǔn)確度[6]。結(jié)果顯示，低(0.25 μg/ml)、中(2.5 μg/ml)及高(10.0 μg/ml)血藥濃度的兩性霉素B準(zhǔn)確度分別為95.86%、96.19%及96.97%，介于100%±15%之間，且RSD均<15%，準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表3。

表3兩性霉素B準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果
Tab3AccuracytestofamphotericinB

質(zhì)量濃度C/(μg/ml)回收率/%RSD/%0.2595.863.752.596.192.0010.096.971.53

2.3.6 質(zhì)控樣品的監(jiān)控：每次進(jìn)行血樣濃度測(cè)定時(shí)，均檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品工作液及血漿質(zhì)控樣品，應(yīng)保證標(biāo)準(zhǔn)品工作液回算血藥濃度在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在±20 %范圍內(nèi)，且低、中及高濃度的血漿質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度應(yīng)<±15%，方可保證待測(cè)血樣檢測(cè)濃度可信[6]。

3 討論

3.1 兩性霉素B的物理性質(zhì)

兩性霉素遇光遇熱易分解，且其稀釋溶液對(duì)光尤為敏感[7]，故兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品的保存及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均應(yīng)避光。僅采取冷藏保存措施時(shí)，兩性霉素B在1個(gè)月后峰面積降低>50%[8]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)冰上操作以減少兩性霉素降解，血漿樣品置于-80 ℃保存比置于-20 ℃更加穩(wěn)定[9]。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為410 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10-11]，故選擇410 nm作為兩性霉素B的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

采用乙腈-醋酸銨水溶液(pH=4.8)[8]、乙腈-甲醇-醋酸銨[3]、乙腈-冰醋酸-水[12]做流動(dòng)相時(shí)，不同配比或梯度洗脫均有拖尾或峰形對(duì)稱(chēng)度不佳等情況，于是改用乙腈-0.01 mol/L KH2PO4作為流動(dòng)相[13]。當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L KH2PO4(V∶V=60∶40)，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃時(shí)，峰寬窄且峰形較好，出峰時(shí)間理想，約為5.5 min，后加入1%三乙胺并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH改善峰形對(duì)稱(chēng)度，當(dāng)pH=5.0時(shí)，峰形對(duì)稱(chēng)度最佳，故采用此色譜條件。

3.4 血漿預(yù)處理的選擇

試用甲醇、乙腈作為血漿蛋白沉淀劑，經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，乙腈作蛋白沉淀劑時(shí)，雜質(zhì)較少且提取回收率高，即乙腈的蛋白沉淀率較甲醇高。此外，亦有文獻(xiàn)采用固相萃取法[1,14-15]進(jìn)行血漿預(yù)處理，但固相萃取法步驟繁瑣，回收率較乙腈沉淀法低，且成本較高[8]。經(jīng)過(guò)比較，采用便捷、經(jīng)濟(jì)且回收率較高的乙腈沉淀法進(jìn)行血漿預(yù)處理。

本檢測(cè)方法為外標(biāo)法高效液相檢測(cè)法，便捷、經(jīng)濟(jì)且準(zhǔn)確，但仍存在一定的樣本間操作誤差。兩性霉素B常用于隱球菌性腦膜炎，常需檢測(cè)腦脊液中兩性霉素B的濃度，因血-腦脊液屏障作用，腦脊液中兩性霉素B的濃度較低，低于本方法檢測(cè)下限。為減少樣本間操作誤差、進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確度與精密度，可考慮采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法、超高壓液相色譜-二級(jí)管陣列檢測(cè)器[16]等方法進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，本方法前處理操作簡(jiǎn)單、快速且經(jīng)濟(jì)，檢測(cè)結(jié)果精密度、穩(wěn)定性良好，回收率高，可用于臨床常規(guī)兩性霉素B血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究。