王思奇(綜述) 蔣 煒(審校)

(復旦大學附屬中山醫(yī)院消化科 上海 200032)

慢性肝病及其相關的肝纖維化、肝硬化和肝癌嚴重危害我國人民健康。肝纖維化是對慢性肝損傷的修復反應,有多種細胞及介質參與,是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經中間環(huán)節(jié)及可逆階段[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化在肝纖維化中占主導地位,肝中一系列的細胞及細胞因子通過影響HSCs的增殖、趨化、收縮及膠原合成,參與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[2]。各種損傷因素刺激肝臟時,可導致肝中固有的細胞和肝臟免疫細胞的免疫表型及功能發(fā)生改變,這種病理狀態(tài)下的免疫應答造成肝臟局部免疫穩(wěn)態(tài)以及微環(huán)境的改變,進而導致疾病慢性化以致纖維化[3]。對肝臟免疫微環(huán)境的研究極大地豐富了我們對肝纖維化的理解,也為疾病的治療開拓了廣闊領域。

肝臟固有細胞

肝細胞 肝臟中約80%由肝細胞組成,盡管肝細胞的主要作用是物質代謝、蛋白質合成和毒素中和等,但也能發(fā)揮免疫細胞的功能。肝細胞負責大多數急性期蛋白質和補體的合成,兩者是抵御病原體的第一道防線,它們不僅具有免疫效應,還可以結合到特定的微生物的表面,增強病原體的檢測[4]。此外,肝細胞有天然免疫受體表達,識別病原體相關配體,以誘導肝細胞固有免疫應答,從而減弱病原體的復制,減少炎癥細胞因子的分泌[5]。

同時,肝細胞也可觸發(fā)適應性免疫應答。肝細胞可表達主要組織相容性復合體-Ⅰ (major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)類分子、抗原提呈相關分子,在炎癥條件下,部分肝細胞還可被誘導表達MHC-Ⅱ類分子,這些分子向肝細胞的基底外側面極化,從而與淋巴細胞相互作用并促使其活化[6]。肝細胞廣泛的免疫功能使其成為肝臟免疫微環(huán)境的重要組成部分,其在肝纖維化中發(fā)揮作用的免疫機制有待進一步研究。

肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs) 通常情況下,肝臟處于免疫耐受狀態(tài),LSECs在肝臟局部免疫穩(wěn)態(tài)維持中起著重要作用,可阻斷針對抗原的適應性免疫反應,誘導調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)的產生或維持CD 8+T細胞處于免疫耐受狀態(tài)[7]。而肝纖維化發(fā)生后,肝臟局部纖維化微環(huán)境的改變促使LSECs的功能由誘導免疫耐受轉變?yōu)榧せ蠲庖叻磻?不僅刺激T細胞分泌IL-6、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等促炎細胞因子,還能高效捕獲抗原,刺激抗原特異性T細胞增殖且抑制Tregs產生[8-9],進而活化HSCs。因此,在正常情況下,LSECs將HSCs維持在靜息狀態(tài);反之,肝纖維化時,LSECs促進HSCs活化,加速肝纖維化進展。

肝臟免疫細胞

庫普弗細胞(Kupffer cells,KCs) 肝中KCs含量豐富,表型多樣,通常根據來源不同,分為傳統(tǒng)的KCs和由外周血單核細胞募集到肝臟的KCs,兩者功能亦有差異。

在小鼠體內,傳統(tǒng)的KCs起源于胚胎卵黃的干細胞,駐存于肝臟,并不斷自我更新,維持肝臟免疫穩(wěn)態(tài)[10]。在慢性肝損傷情況下,KCs可以分泌轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)來活化HSCs[11]。另一類KCs由外周血Ly-6Chi單核細胞通過C-C類趨化因子配體2(C-C chemokine ligand 2,CCL2)/C-C類趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2,CCR2)或CCL1/CCR8趨化通路募集到受損肝臟。這類KCs又可分為兩群[12-13]:一群即剛募集到肝的巨噬細胞,表型為CD11b+F4/80+,其除了直接刺激活化HSCs外,還分泌IL-1β和TNF,進而激活核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB) 通路,促使HSCs存活[11]。另一群在C-X-3C類趨化因子受體1(C-X-3C chemokine receptor 1,CX3CR1)作用下發(fā)育成熟[14],其表型為Ly-6Clow[15],這群募集到肝臟后分化成熟的巨噬細胞,不同于傳統(tǒng)的M1、M2,其分泌基質金屬蛋白酶-9、12、13(matrix metalloproteinase 9、12、13,MMP-9、12、13)降解細胞外基質,同時引起HSCs凋亡[16]。綜上所述,新募集到肝臟的單核細胞促進肝臟纖維化,而在肝臟成熟后,則促使肝臟恢復穩(wěn)態(tài)。由此可知,肝中KCs有高度異質性,不僅僅局限于傳統(tǒng)的M1、M2分類。細胞不同的起源,在肝臟免疫微環(huán)境下受到不同的刺激,均影響KCs的表型及功能。

人的肝臟內的KCs由經典的CD14++CD16-巨噬細胞、非經典的CD14+CD16+巨噬細胞及CD16++細胞組成[17]。肝纖維化進程中的KCs部分由非經典巨噬細胞從外周募集到肝臟,另一部分是在TGF-β、IL-10作用下由CD14++CD16-細胞分化而來[18]。研究發(fā)現,盡管人肝中的CD14+CD16+細胞與小鼠肝內Ly-6Clow細胞表型相同[19],但CD14+CD16+巨噬細胞可分泌TNF、IL-6、IL-8、IL-1β以及IL-13,活化HSCs,促進肝纖維化[17]。人體與小鼠的差異使得針對KCs的纖維化治療尚需進一步研究。

樹突狀細胞(dendritic cells,DCs) DCs憑借專職抗原提呈作用和遷移能力,成為固有免疫與適應性免疫之間重要的紐帶。肝纖維化發(fā)生后,肝臟中DCs數量擴增且表型發(fā)生改變,通過TNF-α刺激鄰近的T細胞和自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)產生大量炎癥因子,并上調HSCs表面的細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和CD40分子表達,使HSCs增殖、活化,進而分泌多種細胞因子與趨化因子,加重肝纖維化[20]。

在CCL4致小鼠肝纖維化的逆轉階段,肝臟DCs數量明顯增多,而敲除經典的DCs后,減少了對活化HSCs的清除,并延緩了肝纖維化逆轉進程[21]。此外,酪氨酸激酶受體3配體(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)的應用誘發(fā)了DCs擴增,伴隨MMP-9分泌增多,加速了肝纖維化逆轉,MMP-9不僅能直接降解肝臟中的膠原,還能募集巨噬細胞、中性粒細胞等固有免疫細胞,進而分泌MMP-8、MMP-13降解膠原[21]。DCs在肝臟纖維化進程中發(fā)揮雙面作用,即在肝纖維化進展階段有加重纖維化的作用,而當致纖維化因素消除后,則發(fā)揮肝臟保護作用。

NK細胞及NKT細胞 肝臟中有豐富的NK細胞,NK細胞可通過TNF相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)、自然殺傷細胞2族成員D(natural-killer group 2 member D,NKG2D)及Fas-Fas配體(Fas ligand,FasL)依賴的途徑殺傷活化的HSCs,進而抑制肝纖維化,但靜息狀態(tài)的和完全活化的HSCs則可以躲避NK細胞的殺傷,因為其表面缺少NK細胞激活配體和TRAIL受體[22-23]。此外,NK分泌的IFN-γ可直接抑制HSCs活化,并且NK細胞還通過信號轉導與轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)途徑抑制HSCs增殖,減弱TGF-β信號轉導,增強對HSCs的細胞毒作用[23-24]。近來研究發(fā)現,在慢性乙型肝炎相關的肝硬化患者病情進展階段,肝內NK細胞所產生的IFN-γ和穿孔素明顯減少,即NK細胞的功能被顯著抑制,這一研究又豐富了我們對NK細胞免疫功能的認識[25]。

除了肝臟本身富有的NKT細胞外,在肝纖維化條件下,外周NKT細胞還可通過CXCR6-CXCL16途徑募集到肝臟并發(fā)揮作用[26]。NKT細胞可通過不同途徑作用于不同病因所致的肝纖維化。在硫代乙酰胺所致肝纖維化模型中,NKT細胞不僅能產生IL-4和IL-13活化HSCs,還能產生IFN-γ,活化巨噬細胞促進肝臟炎癥,加重肝纖維化[27]。而在非酒精性脂肪性肝病相關的肝纖維化模型中,NKT細胞可通過產生刺猬配體和骨橋蛋白活化HSCs,促進纖維化[28]。

固有淋巴細胞(innate lymphoid cells,ILCs) ILCs共同起源于CD127(IL-7Rα+)淋巴祖細胞,并根據細胞表型、分化所需的轉錄因子及功能特征的不同將其分為3組:第1組(ILC1s),表達轉錄因子T-β,分泌細胞因子IFN-γ;第2組(ILC2s):表達轉錄因子GATA3,分泌細胞因子IL-4、IL-5和IL-13;第3組(ILC3s):表達轉錄因子維甲酸相關孤核受體γt (RAR-related orphan receptor γt,RORγt)分泌細胞因子IL-17和IL-22[29]。由上可見,ILCs可表達與輔助性T細胞(helper T cells,Th)類似的轉錄因子并分泌相似的細胞因子。這些ILCs亞群可能代表不同的淋巴細胞譜系,并且在不同的免疫應答中有其獨特的效應功能。

ILCs參與肝臟局部免疫調控的研究剛起步,在CCL4致肝纖維化的小鼠模型中,損傷的肝細胞所釋放的IL-33促使ILC2s在肝臟中聚集活化,并分泌IL-13促進HSCs活化,加重肝纖維化進程[30]。同樣,在刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)引起的急性肝炎模型中,ILC2s也有促炎作用[31]。亦有文獻報道,ILC3s在CCL4誘導的小鼠肝炎模型中通過分泌IL-22起到肝臟保護作用[32]。目前對ILCs的研究主要集中在腸道、肺部等,其在肝臟纖維化免疫微環(huán)境中發(fā)揮什么作用,如何發(fā)揮作用,尚需進一步研究。

CD4+T細胞 根據表達轉錄因子及分泌細胞因子的差異可將CD4+T細胞分為多個亞群,包括Th1,Th2、Th17、Th22、Tregs等,各群體主要通過自身分泌的細胞因子發(fā)揮作用。以往研究多關注Th1與Th2,其中Th1在IL-12作用下分泌IFN-γ等細胞因子,通過調節(jié)MMP與金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)的平衡來發(fā)揮抗肝纖維化的作用[33];而Th2分泌的IL-13通過誘導產生膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和TIMP-1促進肝纖維化[34]。

近年來,Th17與Tregs在肝纖維化中的作用受到更多重視與關注。Th17可分泌IL-17、IL-22、IL-21等細胞因子,據報道在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相關的肝纖維化患者外周血及肝臟中IL-17+CD4+T、IL-21+CD4+T表達較正常人明顯升高,并且與肝臟炎癥水平及纖維化程度呈正相關[35-36]。實驗證明IL-17可作用于HSCs、KCs、單核細胞、肝細胞和膽管細胞等,不僅誘導IL-1β、IL-6、TNF等促炎因子的分泌以及TGF-β產生,還能通過STAT3途徑直接誘導產生膠原[37]。此外,細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)1/2和p38信號通路的活化也是IL-17誘導肝纖維化的重要機制[38]。同時,IL-21活化HSCs的作用也在體外實驗中得到證實[36]。而IL-22可作用于表達IL-22R1和IL-10R2的HSCs,活化STAT3-細胞因子信號通路抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)-p53信號通路,促進HSCs存活,但又將其維持于靜息狀態(tài),表現為肝臟中MMP-9表達的上調及TIMP-1/2表達的抑制[39],同時IL-22也能直接減弱HSCs的活化并下調促炎因子的表達,減輕肝纖維化[40]。對于Tregs在肝纖維化中的作用,實驗證實膽道結扎大鼠模型在清除Tregs后,肝內的T細胞功能恢復,但膽汁淤積、肝纖維化程度更為明顯,說明Tregs負性調節(jié)肝臟中的免疫反應,并限制了炎癥反應的危害[41]。實驗表明,乙肝相關的肝纖維化患者外周血中IL-10和IL-35升高,Tregs可能是通過細胞因子發(fā)揮上述作用,這種炎癥抑制性分子減少了免疫病理損傷,但也因此抑制對病原體的清除,從而加重病毒感染[42-43]。

我們研究發(fā)現,乙肝肝纖維化進程中,肝組織及外周血Tregs/Th17表現為向Th17偏移及相關細胞因子分泌的改變,其穩(wěn)態(tài)的改變可調控HSCs的促纖維化功能并影響肝纖維化進程[44],重塑CD4+T細胞對HBV的免疫應答[45]是抗病毒治療延緩乙肝肝纖維化進程的新機制。

B細胞 就乙型肝炎而言,B細胞相關研究主要集中在乙肝疫苗注射后對于保護性抗體的產生和效價的維持,近年來的相關研究提示B細胞在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中絕不是旁觀者,其可通過不依賴抗體的方式影響肝纖維化進程[46]。已有文獻證明給予B細胞敲除的小鼠注射CCL4,其肝臟纖維化程度明顯低于正常對照小鼠,說明B細胞有促纖維化作用,并且上述作用不依賴抗體和T細胞[47],而可能是通過分泌的IL-6發(fā)揮作用[46]。丙肝相關的肝纖維化患者外周血中的記憶性B細胞而不是原始B細胞數量較正常人明顯減少,其原因可能是記憶性B細胞表達CD83增多,募集到了炎癥狀態(tài)的肝臟,或因為細胞正處于活化后凋亡階段[48-49]。記憶性B細胞在肝纖維化中的具體作用機制及表面分子表達對疾病發(fā)展的預測作用有待進一步研究。

B細胞除了通過產生抗體發(fā)揮作用外,也像CD4+T細胞一樣分泌細胞因子,如調節(jié)性B細胞(regulatory B cells,Bregs)通過分泌IL-10,誘導免疫耐受,維護環(huán)境穩(wěn)態(tài)[50],我們在體外實驗中證實,慢性乙型肝炎及其相關的肝纖維化患者的Bregs可通過細胞間接觸和分泌IL-10來抑制Th1和Th17的功能,并誘導CD4+CD25-T細胞向Tregs轉化,使抑制性細胞因子分泌增加,從而抑制炎癥反應,促進炎癥修復[51]。Bregs在肝纖維化中的作用及其機制有待進一步闡明。

HSCs對淋巴細胞的作用HSCs是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的關鍵細胞,在肝纖維化進程中,HSCs與各種免疫細胞相互作用構成完整的肝纖維化免疫網絡。我們既往研究證實纖維化微環(huán)境的改變可使HSCs獲得遷移的特性[52],且有學者在熒光電鏡下觀察到HSCs可與淋巴細胞直接接觸,這暗示著HSCs與淋巴細胞之間存在密切關系[53]。HSCs可通過與淋巴細胞直接接觸,上調表達黏附分子[54],進而募集淋巴細胞;或分泌MCP-1、IL-8、巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、嗜酸性粒細胞趨化因子、CXCL9及CXCLl0等趨化因子募集淋巴細胞[55]。

研究表明,在炎性刺激下HSCs抗原提呈相關分子表達增加,活化T細胞[56]?；罨腍SCs還可表達抑制性分子B7-H1,與T細胞表面PD-1結合后誘導T細胞凋亡[57],HSCs也可表達B7-H4抑制T細胞活化[58]。而在穩(wěn)態(tài)下HSCs并不表現出上述功能[6]。

HSCs分泌的多種細胞因子可影響淋巴細胞分化,其中TGF-β1誘導T細胞向Tregs分化[59],IL-6則誘導Th17方向的分化。視黃酸(retinoic acid,RA)可促進TGF-β1卻抑制IL-6對T細胞的誘導分化作用[60-61]。RA還可通過髓樣分化因子88信號途徑促使B細胞存活,增加細胞活化程度,誘導免疫球蛋白G的產生及TNF-α、MCP-1和MIP-1α等促炎因子的分泌[62]。

肝纖維化

肝纖維化免疫微環(huán)境的復雜性 肝纖維化免疫微環(huán)境之所以復雜,不僅因為有多種細胞參與,更因為細胞存在著不同的亞型,且在疾病進展的不同階段發(fā)揮不同的作用。由上述討論可知,在肝纖維化進展DCs可加重纖維化,而當致纖維化因素消除后,則對肝臟有保護作用。此外,人體和小鼠肝內表型同為Ly-6Clow的KCs卻發(fā)揮相反的作用。這提示我們不僅要分析某一群細胞的作用,更要研究一群細胞中細胞的多樣性,深入到不同致病因素作用下、疾病不同階段、不同微環(huán)境中細胞的表型和作用。近年來的單細胞測序技術可以明確單個細胞的作用,如將這一檢測應用到肝纖維化免疫微環(huán)境的研究中,將會極大豐富現有的免疫網絡,為肝纖維化的研究提供更多的思路。

肝纖維化研究模型的局限性 在不同病因所致的肝纖維化模型中,免疫微環(huán)境存在很大差異。上述NKT細胞在不同纖維化模型中通過不同途徑發(fā)揮促纖維化作用。在人群中引起肝纖維化的多為HBV。但小鼠并不感染HBV,黑猩猩雖然是HBV易感宿主[63],但動物價格及來源限制了模型的普及。人源化乙型肝炎小鼠模型、HBV轉基因小鼠及高壓水動力轉染小鼠模型雖然模擬了HBV在人體中的感染、復制等過程,但HBV誘導的肝纖維化及肝臟抗病毒免疫反應的建立尚不能很好地實現。因此,建立良好可行的HBV致肝纖維化的動物模型將會更精準地研究免疫微環(huán)境在肝纖維化中的作用,更有利于研究的臨床轉化。

對免疫微環(huán)境研究的延伸 細胞代謝相關的生理活動,如細胞自噬、外泌體分泌等,在維持細胞自身穩(wěn)態(tài)中有重要的作用,同時也參與多種疾病過程。近期我們的研究發(fā)現,乙肝慢性化進程中高遷移率族蛋白B1誘導的Tregs自噬是Tregs細胞維持自身功能的重要機制[64],在今后的研究中,將細胞相關的代謝活動與肝纖維化免疫微環(huán)境研究相結合,探討相互之間的關系,將會更全面、更深入地了解肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

移植到肝臟的干細胞有向肝樣細胞方向分化的能力,分泌相關細胞因子,發(fā)揮抗纖維化、抗氧化的作用,已有臨床試驗證明干細胞移植對肝纖維化有逆轉作用[65]。外來移植免疫細胞到肝臟使肝臟免疫微環(huán)境網絡更加復雜,也將影響肝纖維化進程,明確其中的機制將極大豐富肝纖維化微環(huán)境,為肝纖維化治療提供更好的理論基礎。

依據現有的肝纖維化免疫微環(huán)境研究,根據細胞比例、表型,免疫分子的改變,有效地對疾病進行診斷及預后評估;抑或通過干預機體免疫細胞、免疫細胞效應分子,進而影響免疫微環(huán)境,治療肝纖維化。上述這些新思路的應用還有待進一步驗證。

結語肝臟免疫微環(huán)境是由多種細胞及免疫分子構成的復雜的動態(tài)網絡系統(tǒng),肝纖維化與肝臟免疫微環(huán)境之間相互影響,相互作用(圖1)。肝臟免疫微環(huán)境在肝纖維化中的作用有很好的發(fā)展前景,但是尚有許多問題需要解決。

In liver fibrosis,LSECs could promote progression of fibrosis by inhibiting effects of Tregs and stimulating proinflammatory cytokines secretion of T cells.Infiltrated monocytes in the liver could be classified into CD11b+F4/80+and Ly-6Clowgroups according to their phenotypes.The first group could secret IL-1β and TNF to contribute to HSCs survival.The second group could induce the apoptosis of HSCs and degrade extracellular collagens.Resident liver macrophages activate HSCs through secreting TGF-β and PDGF.DCs promote the proliferation and activation of HSCs not only through stimulating T cells and NK cells to secrete inflammatory cytokines,but also up-regulating the expression of ICAM-1 and CD40 on HSCs.TRAIL,NKG2D,and Fas-FasL pathways could be important for NK cells to kill activated HSCs.In addition,NK cells inhibit the activation and the proliferation of HSCs through IFN-γ and STAT1 pathway.NKT cells activate HSCs through IL-4,IL-13 as well as hedgehog and osteopontin pathways.Th1 cells inhibit fibrosis through secreting IFN-γ.Both of ILC2s and Th2 cells could promote HSCs activation via secreting IL-13.IL-17 and IL-21 of Th17 cells promote liver fibrosis,whereas IL-22 of Th17 cells could induce HSCs senescence.Anti-fibrosis effect of Tregs may achieved through IL-10 and IL-35.B cells may aggravate fibrosis through IL-6.

圖1免疫細胞在纖維化進程中的作用

Fig1Thekeyrolesofimmunecellsintheprogressionofliverfibrosis