余思穎 金曉霞 高 攀 張 農(nóng)

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032)

全球腫瘤導(dǎo)致的常見死亡原因中肝癌位居第2位,主要集中在發(fā)展中國家,2012年發(fā)生率約占全球新增病例的83%,其中約50%的新增病例發(fā)生在中國[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肝癌的臨床診斷和發(fā)病原因及其相關(guān)機制的研究越來越深入。

溶酶體相關(guān)蛋白(lysossomal associated protein,Lamp)是溶酶體膜蛋白家族的統(tǒng)稱,該家族成員結(jié)構(gòu)相似,但功能未知。Lamp2膜蛋白有3種剪切體,即Lamp2a、Lamp2b和Lamp2c[2],分布在不同的組織。腫瘤細(xì)胞中Lamp2a高度糖基化,而糖基化與腫瘤的遷移密切相關(guān)[3]。有研究表明,在乳腺癌中Lamp2a的表達與細(xì)胞的增殖能力及腫瘤細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件的存活有關(guān)[4]。這些均提示Lamp2a的表達差異與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

腫瘤侵襲遷移能力的改變與細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變相輔相成。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)參與胚胎發(fā)育進程并且發(fā)揮著重要作用,機體損傷后一些上皮細(xì)胞依賴于EMT作用重建上皮細(xì)胞層。研究表明抑癌基因的突變及在致癌基因的作用下,腫瘤惡變上皮細(xì)胞通過EMT進程獲得侵襲遷移的能力;同時,多個轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)的信號通路協(xié)調(diào)參與調(diào)控EMT相關(guān)的機制。溶酶體是提供物質(zhì)代謝產(chǎn)物及小分子物質(zhì)的重要場所,Lamp2a是溶酶體膜相關(guān)蛋白家族的成員,與腫瘤代謝相關(guān)因子的調(diào)控密不可分。因此,我們推測肝癌與Lamp2a表達有關(guān),Lamp2a表達可能對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)揮著重要潛在作用。本文旨在研究Lamp2a表達對肝癌細(xì)胞運動、侵襲能力的影響及其相關(guān)的信號通路。

材 料 和 方 法

細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供,用含有10%FBS(美國Gibco公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞于含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721用含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

瞬時轉(zhuǎn)染處理siRNA序列由上海拓然生物科技公司設(shè)計,序列如下:5’-CTGCAATCTGA-TGATTATT-3’。轉(zhuǎn)染前一天在6孔板中鋪板,待細(xì)胞長至40%匯合時,用Lipo2000進行轉(zhuǎn)染,在37 ℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染4～6 h,更換為2 mL新鮮的培養(yǎng)基。

qRT-PCR檢測用qRT-PCR檢測小干擾Lamp2a的干擾效率。檢測干擾組和對照組Lamp2a mRNA水平。將轉(zhuǎn)染過后的細(xì)胞用PBS清洗后,加入預(yù)冷的Tizol吹打裂解后提取總RNA。提取的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行qRT-PCR。配置總體積為10 μL的qRT-PCR體系:SYBR Primix Ex Taq 5 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、PCR前引物0.2 μL、PCR后引物0.2 μL、cDNA模板1 μL,ddH2O 3.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,重復(fù)40個循環(huán)。

Westernblot檢測Western blot檢測MHCC-97H細(xì)胞干擾前后Lamp2a蛋白質(zhì)水平,Lamp2a兔抗(美國Abcam公司,ab18528,按1∶1 000稀釋)。待細(xì)胞長至80%匯合時,用RIPA裂解細(xì)胞,再用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。配置SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,抗體于4 ℃孵育過夜,第2天洗膜3次后用二抗孵育1 h再洗膜3次,發(fā)光并記錄結(jié)果。

Transwell小室運動和侵襲實驗侵襲實驗將凍存于-20 ℃的Matrigel膠置于4 ℃化為液態(tài),預(yù)冷實驗所需的槍頭和培養(yǎng)基;按照工作濃度混勻后加至小室上室,每孔100 μL,放入37 ℃培養(yǎng)箱中凝固2 h;吸取析出的培養(yǎng)基,用胰蛋白酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計數(shù),調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為106個/mL。取200 μL細(xì)胞懸液加至小室上室中,小室下室加入600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,觀察到有細(xì)胞穿出即終止實驗。取出小室,PBS洗3次,每次10 min。甲醇固定20 min,PBS洗3次,每次10 min。結(jié)晶紫染色10 min,洗凈結(jié)晶紫,棉簽擦去小室內(nèi)殘留結(jié)晶紫。拍照記錄5個中倍視野細(xì)胞個數(shù)并求均值。腫瘤細(xì)胞運動實驗方法同侵襲實驗,但無需在小室上室鋪Matrigel膠。

統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,采用雙側(cè)t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

Lamp2asiRNA的干擾效率用Lamp2a siRNA瞬時轉(zhuǎn)染MHCC-97H和SMMC-7721肝癌細(xì)胞,分別通過Western blot和qRT-PCR檢測Lamp2a siRNA的干擾效率。Western blot檢測結(jié)果表明,與對照組相比,干擾組Lamp2a蛋白質(zhì)水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A、1B,P<0.05)。qRT-PCR檢測結(jié)果表明,與對照組相比,干擾組目的基因Lamp2a mRNA表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1C,P<0.05)。

A and B:Lamp2a protein level was decreased in MHCC-97H and SMMC-7721 with siRNA compared with control cells detected by Western blot;C:Lamp2a mRNA level was qualitifiedby qRT-PCR.(1)P<0.05.

圖1在肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和SMMC-7721中檢測Lamp2a敲低效率
Fig1TheefficiencyofLamp2aknockdowninMHCC-97HandSMMC-7721celllines

Lamp2a促進肝癌細(xì)胞體外遷移瞬時轉(zhuǎn)染Lamp2a siRNA后,采用Transwell小室實驗觀察下調(diào)Lamp2a蛋白表達后對肝癌細(xì)胞株MHCC-97H細(xì)胞運動和侵襲能力的影響,發(fā)現(xiàn)干擾組侵襲遷移能力明顯弱于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。同時,在SMMC-7721細(xì)胞株中瞬時轉(zhuǎn)染Lamp2a siRNA后也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果(圖2)。

Lamp2a抑制AKT/GSK3β信號通路PI3K/AKT/GSK3β通路與多種腫瘤臨床治療和疾病發(fā)展有關(guān)。利用Western blot驗證Lamp2a蛋白質(zhì)對AKT/GSK3β通路的作用,發(fā)現(xiàn)下調(diào)Lamp2a蛋白質(zhì)能夠抑制AKT的磷酸化,同時檢測磷酸化位點絲氨酸473和蘇氨酸308位點的磷酸化水平,結(jié)果顯示與對照組相比,干擾組磷酸化水平均下降,GSK3β水平增加(圖3)。

Lamp2a可能參與肝癌細(xì)胞EMT過程EMT與細(xì)胞的侵襲遷移能力密切相關(guān),干擾Lamp2a后肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力減弱是否與EMT有關(guān)？采用Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物,結(jié)果表明,干擾Lamp2a表達使MHCC-97H和SMMC-7721細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏素(E-cadherin)上調(diào),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏素下調(diào),波形蛋白(vimentin)下調(diào)(圖4A和4B)。利用qRT-PCR驗證mRNA水平上EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化也證實Lamp2a與EMT相關(guān)(圖4C)。

討 論

研究表明,Lamp2a參與分子伴侶自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)并且通過分子伴侶自噬對多種疾病的進程產(chǎn)生重要的影響。Lamp2a在乳腺癌[4]、胃癌[5]、肺癌[6]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7]均表達增高,并且Lamp2a與腫瘤的生長和預(yù)后相關(guān)。乳腺癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在T47D細(xì)胞株中過表達Lamp2a能夠激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的在細(xì)胞核中表達增加,胞質(zhì)表達降低,而轉(zhuǎn)錄因子NFκB1在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[8-13]。Lamp2a敲低導(dǎo)致腫瘤的抑癌基因野生型p53的表達增加[14],同時Lamp2a能夠調(diào)控糖酵解進程中的酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸甘油酸激酶[5],從而影響腫瘤細(xì)胞生長。在饑餓條件下上調(diào)Lamp2a表達能夠保護肝癌細(xì)胞,但是同時在肝癌細(xì)胞株HCLM3中上調(diào)及在細(xì)胞株Huh7中下調(diào)Lamp2a蛋白表達時,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲、運動能力并未受到影響[15]。但是,本研究用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和SMMC-7721下調(diào)Lamp2a蛋白表達,通過Western blot和qRT-PCR檢測驗證了siRNA的干擾效率。Transwell小室實驗驗證了下調(diào)Lamp2a的表達能夠明顯使肝癌細(xì)胞的侵襲能力減弱,細(xì)胞運動能力減弱。Lamp2a表達可能參與調(diào)控,具有轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞的運動、侵襲能力。

A and B:The loss expression of Lamp2a could inhibit invasion and migration ability of SMMC-7721 and MHCC-97H cells detected by Transwell assays;C:The number of migratory and invasive cells in the SMMC-7721 and MHCC-97H cell lines.(1)vs.Normal control,P<0.05.

圖2敲低Lamp2a能夠抑制肝癌細(xì)胞侵襲和運動能力
Fig2TheLamp2aknockdowninhibitedtheinvasionandmigrationofSMMC-7721andMHCC-97HcellsdetectedbyTranswellassays

圖3 敲低Lamp2a對pAKT (Ser473)、pAKT (Thr308)、AKT 和 GSK3β蛋白質(zhì)水平的影響Fig 3 The effect of Lamp2a knockdown on the levels of pAKT(Ser473),pAKT (Thr308),AKT and GSK3β proteins

PI3K/AKT/GSK3β信號通路中的信號分子PI3K活化后激活A(yù)KT并引起AKT下游信號通路相關(guān)的信號分子構(gòu)象的改變,影響細(xì)胞生長、增殖及存活和運動等生物學(xué)行為,最終惡化成腫瘤。因此,PI3K/AKT信號分子抑制腫瘤細(xì)胞的表型改變,并且可能對癌細(xì)胞造成嚴(yán)重殺傷力[16]?；罨腁KT分子作用是調(diào)控若干細(xì)胞的細(xì)胞進程,包括細(xì)胞存活,細(xì)胞周期,細(xì)胞生長。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/GSK3β分子還參與了細(xì)胞黏附、侵襲遷移[17-18],與腫瘤的發(fā)展進程密切相關(guān)[19]。AKT的激活能夠促進AKT的磷酸化,進一步激活下游信號分子GSK3β。GSK3β是糖原合酶激酶-32個亞型之一,細(xì)胞內(nèi)以活性狀態(tài)存在,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號通路[20]。GSK3β的下游有關(guān)鍵分子β-catanin[21]依賴GSK3β的磷酸化位點激活后降解β-catanin,引起與之相關(guān)的信號通路變化[22]。AKT和GSK3β不僅影響細(xì)胞生長,還在EMT進程中發(fā)揮重要作用[18]。

A and B:The lamp2a knockdown improved E-cadherin,but decreased N-cadherin and vimentin detected by Western blot;C:The mRNA levels of EMT associated markers expression was detected by qRT-PCR.(1)vs.Normal control,P<0.05.

圖4敲低Lamp2a表達參與EMT進程
Fig4Lamp2aknockdownregulatedEMT

EMT是細(xì)胞上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變,反之則稱為MET,這個過程在胚胎發(fā)育、器官形成以及腫瘤的進展過程發(fā)揮重要作用[23]。腫瘤相關(guān)信號通路中相關(guān)信號分子在EMT進程發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用[23]。研究發(fā)現(xiàn),缺氧、饑餓、生長因子等信號分子都能夠誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。EMT發(fā)生時上皮細(xì)胞標(biāo)志性分子E-鈣黏素和角化蛋白表達受到抑制,而間葉細(xì)胞表型標(biāo)志性分子N-鈣黏素和波形蛋白表達被誘導(dǎo)表達增加[24-26]。本研究通過功能實驗驗證,下調(diào)Lamp2a的表達能夠明顯使肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力減弱;為進一步驗證Lamp2a可能參與調(diào)控侵襲相關(guān)的通路,我們利用Western blot和qRT-PCR檢測了E-鈣黏素、N-鈣黏素及波形蛋白等細(xì)胞表型標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)下調(diào)Lamp2a能夠使上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-鈣黏素表達增加,間葉細(xì)胞表型標(biāo)志物N-鈣黏素、波形蛋白表達減少。這些說明Lamp2a參與EMT相關(guān)進程,下調(diào)Lamp2a可能抑制EMT。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)細(xì)胞株MHCC-97H和SMMC-7721中Lamp2a表達可能調(diào)控AKT/GSK3β信號通路,抑制AKT的磷酸化,增加GSK3β表達;Lamp2a能夠上調(diào)E-鈣黏素,下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物N-鈣黏素和波形蛋白表達,參與抑制EMT進程,使肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力減弱。研究發(fā)現(xiàn)Lamp2a在肝癌組織及癌旁組織中表達并不平衡,Lamp2a高表達的患者生存期明顯高于Lamp2a低表達的患者,說明Lamp2a表達對患者預(yù)后具有重要意義[15],然而Lamp2a蛋白是如何參與調(diào)控相關(guān)的信號通路并影響下游重要信號分子的機制仍需要進一步的深入研究。