陳 頤 劉霄宇顏志平程潔敏龔高全劉凌曉李國平李長煜周國鋒余天柱王小林△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科 上海 200032; 2上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)是指因自發(fā)或診療操作等原因脫離原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,在腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。進(jìn)入血液循環(huán)的CTCs由于受到免疫識別殺傷、血流剪應(yīng)力破壞以及自身凋亡等因素影響,在外周靜脈中的含量極低,通常認(rèn)為一般腫瘤人群的外周血中每1億個血細(xì)胞中僅有1個CTCs[2]。而消化系統(tǒng)血液由門靜脈回流后,經(jīng)肝臟濾過再進(jìn)入外周靜脈,外周靜脈的CTCs含量更低[3]。Allard等[4]報道消化系統(tǒng)腫瘤外周血的平均CTCs計數(shù)為(2～24)/7.5 mL,低于人體其他系統(tǒng)的腫瘤,如前列腺癌(75/7.5 mL)、乳腺癌(84/7.5 mL)、膀胱癌(42/7.5 mL)。消化系統(tǒng)腫瘤中,胰腺癌外周靜脈平均CTCs計數(shù)為2/7.5 mL,低于同樣經(jīng)門靜脈引流的胃癌(24/7.5 mL)和結(jié)直腸癌(4/7.5 mL),這可能與胰腺癌組織中基質(zhì)成分較多有關(guān),與其他腫瘤相比,在同樣條件下進(jìn)入血循環(huán)的CTCs數(shù)量較少。以上因素成為胰腺癌的CTCs研究明顯滯后于其他腫瘤的主要原因之一。

近年來,有研究人員在胰腺癌切除術(shù)中,分別抽取患者門靜脈血和外周靜脈血分離CTCs進(jìn)行計數(shù)比較,發(fā)現(xiàn)門靜脈的單位血樣中CTCs檢出率和計數(shù)均高于外周靜脈[5-6]。因此,胰腺癌的CTCs研究有望通過獲取CTCs含量較高的門靜脈血樣尋找突破口。但是門靜脈系統(tǒng)在腹部較深位置,周圍解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,通常情況下,難以獲取晚期胰腺癌患者門靜脈血,本研究采用介入微創(chuàng)方法穿刺肝內(nèi)門靜脈獲取晚期胰腺癌患者門靜脈血,以期獲得較高豐度的CTCs,為胰腺癌CTCs的分子生物學(xué)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

資 料 和 方 法

病例隊列納入病例為2016年2月—12月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科接受治療的晚期胰腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)無法手術(shù)切除的晚期胰腺癌(依據(jù)NCCN 2016版);(2)ECOG評分<2分;(3)未接受過全身化療、放療等針對胰腺癌的治療;(4)白細(xì)胞計數(shù)≥4×109/L,血小板計數(shù)≥100×109/L;(5)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶≤1.5倍正常值、血清總膽紅素≤1.5倍正常值(伴梗阻性黃疸的患者先行經(jīng)皮經(jīng)肝膽管引流);(6)肌酐≤115 μmol/L;(7)凝血酶原時間延長≤2 s。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有肝臟穿刺禁忌癥;(2)血管造影禁忌癥;(3)患者有其他腫瘤病史;(4)預(yù)計生存期<3個月。本研究涉及的標(biāo)本收集經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。

晚期胰腺癌門靜脈血獲取局部晚期病例如能在超聲導(dǎo)引下穿刺原發(fā)灶,用21G超聲穿刺針(日本八光公司)行原發(fā)病灶抽吸活檢;伴肝轉(zhuǎn)移病例,超聲導(dǎo)引下用18G活檢針(美國Cook公司)行轉(zhuǎn)移灶穿刺活檢。超聲導(dǎo)引下用21G超聲穿刺針,經(jīng)右側(cè)肋間經(jīng)皮穿肝并穿刺進(jìn)入門靜脈右支主干,確認(rèn)針尖位于門靜脈腔內(nèi)后拔除針芯,抽取門靜脈血15 mL,拔除穿刺針,部分患者同時抽取外周靜脈血7.5 mL。采用Seldinger穿刺法穿刺股動脈,行動脈化療灌注/化療栓塞術(shù),術(shù)后常規(guī)心電監(jiān)護(hù)6 h。

CTCs的富集打開CTChip芯片,記錄芯片編號,微孔朝下放入到芯片卡槽中。使用ClearCell?FX1收集CTCs。

CTCs的涂片與染色配制抗體及相關(guān)試劑:一抗CD45,一抗CK18,二抗MS488,二抗RB568,DAPI溶液,4% PFA固定液,Trition×100穿透液。將細(xì)胞沉淀20 μL液體重懸后,加入到用免疫組化筆所畫的區(qū)域內(nèi),放置通風(fēng)處吹干;4% PFA固定液,固定15 min;Trition×100穿透液,充分接觸1 h;PBS沖洗5 min,1次;一抗CD45和CK18室溫靜置30 min;PBS沖洗5 min,3次;加二抗溶液MS488和RB568,室溫靜置30 min;同樣PBS沖洗5 min,3次;經(jīng)DAPI/CK18/CD45染色后,在InCell儀器中查看時,腫瘤細(xì)胞應(yīng)在藍(lán)色和綠色通道呈現(xiàn),白細(xì)胞應(yīng)在藍(lán)色和紅色通道呈現(xiàn)(圖1)。

CTCs:DAPI+/CK+/CD45-;WBC:DAPI+/CK-/CD45+(DAPI:blue;CK:green;CD45:red).

圖1CTCs鑒定
Fig1CTCsidentification

CTCs圖像獲取與計數(shù)應(yīng)用InCell Analyzer 2000獲取CTC細(xì)胞圖像及計算CTC數(shù)量。

CTCs的CD133表征(1)準(zhǔn)備試劑:一抗CD133,CK18;二抗MS488,RB568;DAPI溶液;Trition 溶液;PBS溶液;Immuno Enhancer Kit稀釋液,4% PFA固定液。(2)涂片固定與染色:將上述CTCs固定和染色中一抗替換成一抗CD133,CK18,余相同。(3)CD133+CTCs染色圖像獲取與計數(shù):同上。

觀察指標(biāo)(1)術(shù)中觀察動脈造影表現(xiàn)、有無出血征象、術(shù)后有無出血癥狀和體征。(2)部分患者門靜脈和外周靜脈CTCs分別計數(shù),并進(jìn)行比較。(3)所有患者門靜脈CTCs計數(shù),觀察性別、年齡、CA19-9、CEA、原發(fā)灶是否侵犯門靜脈系統(tǒng),是否伴有肝轉(zhuǎn)移、原發(fā)灶部位以及原發(fā)灶最大徑和CTCs計數(shù)的相關(guān)性。(4)分別觀察門靜脈和外周靜脈CTCs的CD133表征。

統(tǒng)計學(xué)方法采用EpiData 3.1軟件錄入患者基線數(shù)據(jù)和臨床信息,分組比較采用Wilcoxon秩和檢驗或χ2檢驗。研究中數(shù)據(jù)缺失值不納入分析。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗,檢驗水準(zhǔn)α設(shè)為0.05。所有相關(guān)性研究采用最小二稱法擬合線性相關(guān)。

結(jié) 果

患者基本信息共計入組患者29例,其中男性19例、女性10例,平均年齡62.9歲(42～79歲),局部晚期16例、伴肝轉(zhuǎn)移13例(表1)。17例患者胰腺癌診斷經(jīng)病理證實,12例經(jīng)影像學(xué)和血液生化檢查證實。29例患者均成功獲取門靜脈血15 mL,術(shù)中肝動脈造影均未見造影劑外滲征象,術(shù)后亦未出現(xiàn)失血癥狀和體征。

表1 29例晚期胰腺癌患者臨床病理資料Tab 1 Baseline characteristics of 29 patients with advanced pancreatic cancer

M:Male;F:Female;Y:Yes;N:No.

CTCs計數(shù)29例患者的門靜脈血中均檢測到CTCs,門靜脈CTCs平均計數(shù)為(282±50)/7.5 mL。前期14例外周靜脈取血的患者中,9 例(64.2%)患者外周靜脈檢測到CTCs,CTCs平均計數(shù)為(21±7)/7.5 mL。前期14例同時采集門靜脈血和外周靜脈血的患者門靜脈CTCs平均計數(shù)為(237±78)/7.5 mL,顯著高于外周靜脈(P=0.010 2,圖2)。

臨床病理特征和CTCs計數(shù)的相關(guān)性分析(表2) 29例患者中,13例(45%)伴有肝轉(zhuǎn)移的患者門靜脈CTCs平均計數(shù)為(449±81)/7.5 mL;16例(55%)局部晚期患者門靜脈CTCs計數(shù)為(126±18)/7.5 mL,肝轉(zhuǎn)移患者門靜脈CTCs計數(shù)顯著高于局部晚期患者,門靜脈CTCs數(shù)量與患者是否伴肝轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P=0.000 4,圖3)。

The mean count of CTCs in portal vein of (237±78)/7.5 mL was significantly higher than that in the peripheral vein blood of (21±7)/7.5 mL.

圖229例晚期胰腺癌患者門靜脈與外周靜脈CTCs計數(shù)
Fig2CTCscountinportalveinandperipheralveinof29patientswithadvancedpancreaticcancer

表2 門靜脈血CTCs計數(shù)和晚期胰腺癌患者臨床特征的相關(guān)性Tab 2 The correlation between the CTCs count and the clinical characteristics of patients with advanced pancreatic cancer

17例(59%)原發(fā)病灶侵犯門脈系統(tǒng)患者的門靜脈CTCs平均計數(shù) (281±73)/7.5 mL,12例門靜脈系統(tǒng)未受侵犯患者門靜脈CTCs平均計數(shù)(282±66)/7.5 mL,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.991 4)。29例患者原發(fā)腫瘤瘤體最大徑1.8～6.0 cm,瘤體最大徑與門脈血中CTCs計數(shù)無顯著線性相關(guān)(圖4)。

圖3肝轉(zhuǎn)移晚期胰腺癌患者門靜脈CTCs計數(shù)顯著高于無肝轉(zhuǎn)移患者
Fig3ThemeancountinportalveinsamplesofCTCsinpatientswithadvancedpancreaticcancerandlivermetastasiswassignificantlyhigherthanpatientswithoutlivermetastasis

圖4 胰腺癌患者門靜脈血CTCs與原發(fā)腫瘤最大徑的相關(guān)性Fig 4 The correlation between the number of CTCs and the tumor diameter

前期14例患者門靜脈CTCs平均計數(shù)237/7.5 mL [(8～908)/7.5 mL],CD133+細(xì)胞1～95個,占5.9%(2.5%～12%),相應(yīng)患者外周靜脈CTCs未發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞(圖5)。

討 論

近年來,通過外科術(shù)中獲取胰腺癌門靜脈血,分離獲得較高濃度的CTCs,使胰腺癌CTCs的研究看到了新的希望。本研究采用介入微創(chuàng)穿刺技術(shù)穿刺肝內(nèi)門靜脈,獲取29例晚期胰腺癌患者門靜脈血樣均獲得成功,未出現(xiàn)并發(fā)癥。目前,已報道的唯一采用微創(chuàng)技術(shù)獲取門靜脈血進(jìn)行CTCs檢測的研究來自Catenacci團(tuán)隊[7]。與Catenacci等[7]的報道相比較,本研究采用超聲導(dǎo)引,較超聲內(nèi)鏡導(dǎo)引操作更為簡便;21G穿刺針直徑更細(xì),操作也更為安全,更值得在臨床上推廣應(yīng)用。本研究前期14例晚期胰腺癌患者平均門靜脈CTCs明顯高于外周靜脈血的,表明胰腺癌的直接引流靜脈內(nèi)CTCs濃度較高,預(yù)示晚期胰腺癌的門靜脈CTCs有著巨大的潛在研究價值,可以為胰腺癌CTCs的分子生物學(xué)和功能研究創(chuàng)造條件[8]。

A:DAPI+CK identified CTCs (white arrow);B:DAPI+CD133 identified CD133+CTC (white arrow);C:Merged figure (DAPI:Blue;CK:Green;CD133:Red).

圖5門靜脈部分CTCs表達(dá)CD133
Fig5CD133+CTCsinportalvein

本研究伴肝轉(zhuǎn)移患者門靜脈CTCs計數(shù)明顯高于局部晚期患者(P=0.000 4),這直接表明了門靜脈CTCs和肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。有學(xué)者在其他消化道腫瘤的研究中得到相似的結(jié)果,Rahbari等[9]獲取同屬門靜脈系統(tǒng)的腸系膜上靜脈血液,發(fā)現(xiàn)Ⅲ期和Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的CTCs檢出率有顯著差別。CTCs是介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),通過動態(tài)監(jiān)測門靜脈CTCs,預(yù)判胰腺癌患者微轉(zhuǎn)移的發(fā)生,以及晚期患者病程中是否會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,具有重要的臨床研究價值[10]。

生物法和物理法是目前最常采用的兩種CTCs的富集技術(shù)[11]。CellSearch?系統(tǒng)是生物法中免疫吸附技術(shù)的代表,它可以捕獲上皮表型-上皮細(xì)胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)表達(dá)陽性的CTCs,是目前唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌預(yù)后判斷CTCs檢測系統(tǒng)[12-14]。但是,CTCs在生成和轉(zhuǎn)移的過程中會產(chǎn)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),也就是腫瘤細(xì)胞失去極性、黏附性等上皮表型,轉(zhuǎn)化為代表較高遷移侵襲能力的間質(zhì)表型,從而具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力[15]。CellSearch?系統(tǒng)會遺漏具有間質(zhì)表型的CTCs,無法完整分析整個CTCs群體特征。Khoja等[16]同時使用CellSearch?系統(tǒng)和屬物理法的ISET系統(tǒng)檢測了27例胰腺癌患者,并進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)ISET系統(tǒng)的CTCs檢出率為93%,而CellSearch?系統(tǒng)的檢出率僅為40%。ISET系統(tǒng)檢出的病例中,有9例為EpCAM陰性,3例為EpCAM弱表達(dá)。因此,CellSearch?系統(tǒng)檢出的EpCAM陽性CTCs僅為CTCs中的一個亞群。本研究采用的ClearCell?FX系統(tǒng)的分離過程不會對CTCs造成損傷,分離出的CTCs具有細(xì)胞活性,完全可以用于下游分子檢測、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞水平研究和腫瘤動物模型建立等實驗[17-18]。值得注意的是,具有間質(zhì)表型的CTCs可能更具侵襲性。有研究者分析了乳腺癌患者血樣中的EpCAM陰性CTCs[19],發(fā)現(xiàn)其中HER/EGFR/HPSE/Notch表達(dá)均為陽性的亞群具有較高的致瘤性,并證實這部分無法被CellSearch系統(tǒng)檢出的CTCs在裸鼠體內(nèi)可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶的形成。本研究中所有病例均為晚期胰腺癌,同一腫瘤人群中,晚期患者具有間質(zhì)細(xì)胞表型的CTCs細(xì)胞比例明顯高于早期患者[20]。

在其他腫瘤的CTCs研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),有干細(xì)胞特征的CTCs和患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),具有致瘤性和對化療藥物更強(qiáng)的耐受性[21-23]。CD133是一種跨膜糖蛋白,最初發(fā)現(xiàn)其在人體造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞等干細(xì)胞群中有一致的表達(dá)。目前研究表明,結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中均有CD133+的腫瘤細(xì)胞亞群,已成為多種實體腫瘤干細(xì)胞主要標(biāo)志物之一[24]。腫瘤細(xì)胞群中,表達(dá)CD133的亞群擁有更強(qiáng)大的自我更新、侵襲轉(zhuǎn)移和致瘤能力[25-26];腫瘤人群中,CD133的表達(dá)和患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[27-29]。目前僅有通過CD133表征觀察胰腺癌外周靜脈血CTCs的研究報道[29]。本研究門靜脈血中CD133+CTCs為5.9%,表明晚期胰腺癌患者的門靜脈CTCs中存在干細(xì)胞特征細(xì)胞亞群;外周靜脈血未發(fā)現(xiàn)CD133+CTCs,可能由于門靜脈CTCs經(jīng)過肝臟的“濾過”、機(jī)體免疫殺傷或自身凋亡,在外周靜脈血中數(shù)量明顯減少,已無法檢出CD133+CTCs。這一結(jié)果提示胰腺癌的直接引流靜脈-門靜脈血樣中的CTCs較外周靜脈更具有研究價值。

綜上所述,晚期胰腺癌患者的單位門靜脈血CTCs計數(shù)明顯高于外周靜脈,門靜脈CTCs計數(shù)與是否伴有肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。晚期胰腺癌患者門靜脈CTCs中部分具有干細(xì)胞表征,具有潛在研究價值。