李曉玉 ，陳忠偉 ，趙 武 ，段群棚 ，張 寧 ，郭 旋 ，蔣家霞 ，林昌華 ，胡庭俊 ，何 穎

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團金光有限公司，廣西 南寧 530022；4.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團新興有限公司，廣西 柳州 545112）

螺旋藻（Spirulina）不僅營養(yǎng)豐富均衡，而且很容易被消化吸收，它含有很多生物活性成分，如機體所需的氨基酸種類、藻藍蛋白、螺旋藻多糖、β-胡蘿卜素、葉綠素和維生素等［1］，這些活性成分具有很重要的藥理活性，如提高機體免疫力、促進抗氧化和抗炎、防治高脂血癥、抗貧血以及促進骨髓造血作用等［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻主要通過螺旋藻多糖和藻藍蛋白對機體免疫產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用［4］。許嬌紅等［5］研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖對小鼠的體液免疫和NK細胞活性均有增強作用。另外，螺旋藻多糖還可通過促進骨髓細胞的增殖來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［6］，藻藍蛋白能夠促進聚羥基脂肪酸酯刺激淋巴細胞的轉(zhuǎn)化功能［7］。還有研究表明，無論在體內(nèi)還是體外，藻藍蛋白都可以抑制脂質(zhì)體過氧化反應(yīng)［8］，具有抗氧化生物活性、減輕炎癥的功能［9-11］。目前，畜禽免疫抑制性疾病的流行給世界畜牧業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，同樣，當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激時所產(chǎn)生過量的氧自由基會導(dǎo)致機體組織器官的衰老或引發(fā)疾病，因此，螺旋藻在獸用方面的深入研究對當(dāng)前畜禽免疫抑制性疾病的防治，以及在動物健康養(yǎng)殖中具有重要意義。為確保螺旋藻在臨床動物使用上的安全性，該試驗進行了螺旋藻急性及亞慢性毒性試驗，并研究了不同劑量螺旋藻水溶液和螺旋藻粉末對小鼠的臨床體征、體重、飼料利用率、白細胞分類計數(shù)、血液生化指標(biāo)和病理組織學(xué)變化的影響，以觀察螺旋藻是否具有毒副作用及可能出現(xiàn)的毒副作用反應(yīng)，旨在為螺旋藻能否應(yīng)用于動物臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF昆明小鼠，雌雄各半，體重20～25 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。環(huán)境及鼠籠消毒后，于購買后新環(huán)境下適應(yīng)飼喂3 d，以減少應(yīng)激，每天人工照明12 h。灌胃前禁食8～12 h，不限制飲水。

1.1.2 受試藥品：螺旋藻粉末，由北海生巴達生物科技有限公司提供，中國科學(xué)院水生物研究所監(jiān)制。

1.2 方法

1.2.1 半數(shù)致死量測定：選用8周齡、體重為 20～25 g昆明種小鼠16只，隨機分成4組，每組4只，分籠飼養(yǎng)。參考藥物安全性評價及螺旋藻粉末最大溶解度設(shè) 10、5、2.5、1.25 g/kg 4 個劑量組。 試驗前12 h禁食，自由飲水。試驗開始第1天，在24 h內(nèi)分3次，每次0.8 mL螺旋藻水溶液（螺旋藻粉末溶于蒸餾水）對小鼠進行灌胃給藥。記錄小鼠采食、飲水量變化和是否有中毒或死亡的癥狀，觀察中毒特點及中毒效果特性的變化，并在第8天，全部斷頸處死，肉眼觀察小鼠的肝﹑心、脾﹑肺﹑腎及胃腸道有無眼觀病理變化。若無異常，進行急性毒性最大耐受量試驗。

1.2.2 最大耐受量試驗：選用8周齡、體重為 20～25 g昆明小鼠20只。試驗前12 h斷糧，自由采水。試驗開始24 h內(nèi)分3次，每次0.8 mL螺旋藻水溶液灌胃給藥，劑量為10 g/kg（螺旋藻粉末最大溶解度）。給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，24 h內(nèi)注意觀察其是否出現(xiàn)中毒現(xiàn)象并及時記錄其異常情況，連續(xù)觀察7 d，每天1～2次，觀察小鼠的采食、飲水、被毛狀況、活動及精神狀況等。對死亡小鼠進行剖檢，于第8天斷頸處死全部小鼠，剖檢，觀察并記錄各組織器官有無異常。

1.2.3 亞慢性毒性試驗：將80只昆明小鼠隨機分為 4組（A、B、C、D 組），其中，A 組為空白對照組、B 組為螺旋藻粉末低劑量組［2.5 g/（kg·BW）］、C組為中劑量組［5.0 g/（kg·BW）］、D 組為高劑量組［10.0 g/（kg·BW）］，每組 20 只，雌雄各 10 只，分籠飼養(yǎng)?？瞻讓φ战M：給予未添加螺旋藻粉末的常規(guī)飼料，連續(xù)28 d；高劑量組：給予螺旋藻粉末添加飼料 （濃度為 4 mg/g 飼料），5 g/（只·d）， 連續(xù)28 d；中劑量組：給予螺旋藻粉末添加飼料（濃度為 2 mg/g 飼料），5 g/（只·d）， 連續(xù) 28 d； 低劑量組：給予螺旋藻粉末添加飼料（濃度為 1 mg/g飼料），5 g/（只·d），連續(xù) 28 d，自由飲水。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 臨床體征：試驗期間觀察小鼠是否出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如精神狀態(tài)、呼吸、行為及排糞等情況變化。給藥后觀察28 d。記錄小鼠不良反應(yīng)出現(xiàn)的時間、程度、持續(xù)時間。觀測的不良反應(yīng)包括過敏反應(yīng)、局部刺激，消化系統(tǒng)表現(xiàn)如流涎等。不良反應(yīng)觀察時間：對試驗中出現(xiàn)不良反應(yīng)者，應(yīng)觀察至癥狀恢復(fù)正常。

1.2.4.2 體重及飼料利用率：試驗前、試驗結(jié)束時對小鼠稱體重。每7 d于喂料前稱重1次，而后計算小鼠的增重、增重率及飼料利用率。

1.2.4.3 樣品采集及處理：在29 d時，每組小鼠斷尾取尾尖血做白細胞計數(shù)及白細胞分類計數(shù)，在小鼠眼眶采血，所采血液放置于不加抗凝劑的離心管中，血液樣品于室溫下靜置2 h，然后2 500 r/min離心5 min，取上層血清，置-80℃保存，用于血液生化指標(biāo)分析。采血后頸椎脫臼處死，觀察各組織器官有無異常，如有異常拍照并記錄，如有需要可將異常組織器官固定后做病理切片觀察。采集肝臟、脾臟和腎臟稱重，計算肝臟、脾臟和腎臟的臟器指數(shù)。

1.2.4.4 白細胞計數(shù)以及分類計數(shù)：用移液槍取小鼠尾尖抗凝血0.02 mL，往其中加入0.38 mL的3%乙酸溶液 （同時加入1%結(jié)晶紫溶液使白細胞核著色）稀釋血液，混勻，吸取少量液體加入計數(shù)池內(nèi) （至計數(shù)池內(nèi)剛好無空泡即可），靜置1 min，顯微鏡觀察并用低倍鏡計數(shù)對角線位置上的2個大方格的白細胞總數(shù)。小鼠剪斷尾尖取一小滴血做血涂片，待涂片干燥后，加入瑞士—姬姆薩染液，靜置染色 5～7 min，蒸餾水沖洗，烘干。低倍鏡下檢查涂片，觀察白細胞的分布情況并選取沒有紅細胞層疊的區(qū)域 （通常為涂片尾部即火焰部），將載玻片從最上端向最下端移動，在連續(xù)的視野中對白細胞進行分類及計數(shù)。

表1 小鼠體重變化情況 g

1.2.4.5 血清生化指標(biāo)分析：按試劑盒操作測定血液中總蛋白（TP）、白蛋 白（Ab）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（CHOL）、乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖（Glu）含量。

1.2.4.6 病理組織學(xué)觀察：在29 d采血后處死小鼠并將肝臟和腎臟浸泡于10%福爾馬林溶液中，固定7 d，后流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度為 4～4.5 μm，后進行蘇木素伊紅（HE）染色。切片于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析：該試驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22軟件中的比較均值—單因素方差分析法分析，并采用多重比較法（LSD Duncan）進行試驗組間的顯著性檢驗。結(jié)果以Means±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 半數(shù)致死量測定結(jié)果

受試小鼠經(jīng)口3次灌服螺旋藻水溶液后，各劑量組小鼠飲水采食、活動及精神狀況均正常，各試驗組均未見死亡病例，解剖小鼠，觀察各主要臟器，未出現(xiàn)肉眼可見的病理變化。結(jié)果表明，無法測得螺旋藻水溶液的半數(shù)致死量（LD50），故接下來進行最大耐受量試驗。

2.2 最大耐受試驗結(jié)果

以10 g/kg計量螺旋藻粉末灌胃后，連續(xù)觀察7 d，動物全部存活，飲食正常，活動及精神狀況未見異常，剖檢觀察主要臟器未見異常變化。

2.3 亞慢性毒性試驗結(jié)果

2.3.1 臨床表現(xiàn)：試驗期間，小鼠采食飲水及活動狀況均無異常，無死亡現(xiàn)象。

2.3.2 螺旋藻對小鼠體重、增長率及飼料利用率的影響：由表1可知，不同劑量螺旋藻粉末添加飼料對小鼠體重的影響與飼喂常規(guī)飼料的A組相比，差異均不顯著（P＞0.05）。由表 2可知，C組能提升小鼠的增重率，與飼喂常規(guī)飼料的A組比較差異顯著（P＜0.05）；其他劑量組小鼠的增重率及飼料利用率與A組比較差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，螺旋藻對小鼠體重和飼料利用率無影響。

表2 小鼠增重率及飼料利用率

表3 螺旋藻對小鼠臟器指數(shù)的影響

表4 螺旋藻對小鼠血液白細胞分類計數(shù)的影響（n=20）

表5 螺旋藻對小鼠血清生物化學(xué)指標(biāo)的影響

2.3.3 螺旋藻對小鼠臟器指數(shù)的影響：由表3可知，各劑量螺旋藻小鼠的各臟器指數(shù)與A組相比，差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，螺旋藻對小鼠的肝、腎臟及脾臟無顯著影響。

2.3.4 螺旋藻對小鼠淋巴細胞的影響：由表4可知，各劑量螺旋藻小鼠的白細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比、酸性淋巴細胞百分比、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比均在正常范圍內(nèi)波動，且與A組比較差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3.5 螺旋藻對小鼠血清生化指標(biāo)的影響：由表5可知，C組ALT值升高，與A組相比差異顯著（P＜0.05）；D組Cr值升高，與 A組相比差異顯著（P＜0.05）； 其他劑量組的 TP、Ab、AKP、ALT、AST、Cr、BUN、CHOL、LDH、Glu 值與 A 組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3.6 病理組織學(xué)觀察：觀察各組肝臟組織切片可知，空白對照組及各劑量組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)可辨，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞核清晰可見，相互間界限明顯。觀察各組腎臟切片可知，空白對照組及各劑量組腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰可辨，細胞核清晰可見，無明顯異常（見圖1）。

3 討論

螺旋藻營養(yǎng)成分豐富、全面、均衡，并且含有多種生物活性成分。盡管迄今為止，藻類資源的保健與功能價值研究還不夠深入，但是其在免疫調(diào)節(jié)、抗癌癥、抗病毒以及血液生物化學(xué)等方面的功能應(yīng)用越來越受到研究人員的重視。該試驗通過對小鼠灌胃不同劑量的螺旋藻水溶液進行急性毒性試驗和在小鼠飼料中添加不同劑量的螺旋藻粉末進行亞慢性毒性試驗，觀察小鼠的臨床表現(xiàn)、體重、增重率、飼料利用率、臟器指數(shù)、生化指標(biāo)以及病理組織變化，為螺旋藻的安全性評價和臨床使用安全劑量的篩選提供了一定的試驗參考。

在螺旋藻半數(shù)致死量試驗中，灌胃給藥7 d內(nèi)，各劑量組小鼠均未見死亡，采食飲水及活動狀況均未見異常，按照毒理學(xué)評價標(biāo)準［12］，當(dāng)藥物的LD50＞5 g/kg時，該藥物屬于實際無毒性物質(zhì)。由于無法測出螺旋藻水溶液的LD50，因此需做最大耐受量試驗以反映藥物的安全性。在最大耐受量試驗中，20只受試小鼠在 10 g/（kg·BW）體重給藥劑量下，7 d內(nèi)均無小鼠死亡，采食、飲水及活動狀況未見異常。剖檢小鼠時，內(nèi)臟器官均無眼觀病變。說明小鼠對螺旋藻的最大耐受劑量10 g/（kg·BW）體重，為實際無毒。

圖1 病理組織學(xué)變化（HE，400×）

在亞慢性毒性試驗中，螺旋藻粉末分別以10.0、5.0、2.5 g/kg 劑量，連續(xù)用藥 28 d，在觀察期內(nèi)未見小鼠有不良反應(yīng)，精神狀態(tài)良好、飲食正常。試驗期間，各劑量組與A組（空白對照組）體重均呈穩(wěn)定增長趨勢，說明螺旋藻對小鼠的增重?zé)o不良影響，其中，飼喂螺旋藻粉末添加飼料5.0 g/（kg·BW）組（C 組）增重率顯著高于 A 組（P＜0.05），說明螺旋藻可能對機體具有一定的促生長效果，需后續(xù)進一步研究試驗確證。該試驗結(jié)果與李鳳文等［13］、胡嘉想［14］進行螺旋藻及其相關(guān)產(chǎn)品的亞慢性毒性試驗中，其體重、增重率、飼料利用率均無異常的結(jié)果一致。臟器指數(shù)是評價機體臟器組織狀況的重要指標(biāo)，白細胞總數(shù)及分類計數(shù)情況是衡量免疫功能的重要指標(biāo)。結(jié)果表明，各劑量螺旋藻小鼠的各臟器指數(shù)以及白細胞分類計數(shù)與 A組相比差異不顯著（P＞0.05），并且白細胞分類計數(shù)均在正常范圍內(nèi)波動，提示螺旋藻對小鼠的肝、脾、腎臟及免疫功能無顯著影響。各試驗組小鼠血清生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)變動，表明螺旋藻粉末分別以 10.0、5.0、2.5 g/kg劑量應(yīng)用時對小鼠生理生化功能無不良影響。螺旋藻粉末按10.0、5.0、2.5 g/kg劑量應(yīng)用后進行病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)A組及各給藥組的肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)可辨，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞核清晰可見，相互間界限明顯；同樣A組及各給藥組的腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰可辨，細胞核清晰可見，因此螺旋藻對小鼠肝、腎無毒副作用。 同時胡錦華等［15］、孫曉等［16］進行螺旋藻對器官毒性作用的研究時還發(fā)現(xiàn)，螺旋藻對肝臟以及腎臟有保護作用。

綜合分析各項檢測指標(biāo)，表明螺旋藻實際無毒，在臨床上應(yīng)用是安全的，可作為廣西優(yōu)勢資源和新興的農(nóng)業(yè)資源加入到我國生態(tài)養(yǎng)殖的行列中。