白 潔，紀(jì)文靜，丁永年，彭媛媛，陳源文

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，新疆 烏魯木齊830028；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200092)

N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysylproline, AcSDKP)是1種內(nèi)源性乙?；碾幕衔?，其前體胸腺素β4通過脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase，POP)水解生成，胸腺素β4-POP-AcSDKP軸廣泛存于哺乳動物多種器官與體液中[1]。研究[2]證實(shí):AcSDKP具有多種重要生物學(xué)功能，其中對心臟、腎臟等重要器官的纖維化或重塑具有較強(qiáng)的抑制作用。近年研究[3]顯示：肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中AcSDKP起著極為重要的效應(yīng)，在肝細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及肝損傷修復(fù)等方面具有重要調(diào)控作用。目前研究[4]證實(shí)：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE) 是內(nèi)源性AcSDKP特異性水解酶，在體內(nèi)外均有極強(qiáng)的AcSDKP水解活性。目前這些調(diào)控作用的具體機(jī)制尚不清楚，因此也是臨床研究的熱點(diǎn)問題之一。肝纖維化動物模型較多，其中膽總管結(jié)扎肝纖維化模型是應(yīng)用較為普遍的方法之一，因此本研究選擇膽總管結(jié)扎制備大鼠肝纖維化模型，分析肝纖維化模型大鼠內(nèi)源性AcSDKP的動態(tài)變化以及其調(diào)節(jié)因素的改變情況，以期為臨床治療肝纖維化提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器 普通級4周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量(190±18)g，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001；均予以動物食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，維系12 h光照的晝夜周期，且本研究對動物處置方法符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會要求。Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)和透明質(zhì)酸(HA)試劑盒均購自上海信裕生物技術(shù)有限公司，AcSDKP檢測ELISA試劑盒購自法國BIO公司。RM2255型號石蠟切片機(jī)購自德國萊卡公司，Multi-analyst Software凝膠圖像分析處理軟件購自美國Gel公司，AU5800型自動生化分析儀購自美國貝克曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將45只SD大鼠分為3組，每組15只：模型組，采用膽總管結(jié)扎建立肝纖維化動物模型；阻斷組，大鼠予以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)卡托普利(40 mg·kg-1)每天灌胃1次，連續(xù)灌胃8周，再采用膽總管結(jié)扎建立肝纖維化動物模型；對照組，予以開腹，但不結(jié)扎膽總管。3組大鼠的周齡、體質(zhì)量、飲食以及大小便等因素比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，具有可比性。

1.3 肝纖維化動物模型的建立 SD大鼠正常適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，自尾靜脈內(nèi)注射苯巴比妥2 mg·kg-1，消毒后開腹，分離膽總管并予以結(jié)扎，再逐步關(guān)腹，術(shù)后予以常規(guī)喂養(yǎng)，本研究中所有大鼠肝纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途ㄟ^肝臟病理檢查證實(shí)造模建立成功[5]。3組大鼠均分別在1、2和4周后各處死5只動物。

1.4 肝功能和纖維化指標(biāo)檢測 3組大鼠均在處死前經(jīng)下腔靜脈采集靜脈血，以3 000 r·min-1離心后，收集上層血清標(biāo)本，保存在-20℃冰箱中待檢查。應(yīng)用自動生化分析儀檢測血清樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TB)和白蛋白(ALB)水平。應(yīng)用放射免疫法測定血清樣本中PCⅢ、CⅣ和HA水平。

1.5 肝纖維化組織病理學(xué)觀察 肝組織標(biāo)本分為2份，一份肝組織置于液氮冷凍后，-80℃冰箱中保存，采用ELISA法檢測肝臟組織樣本中AcSDKP水平；另一份肝組織置于10%緩沖甲醛中固定24 h，石蠟包埋，組織病理切片層厚4 μm，HE染色，評估肝臟肝組織纖維化及重構(gòu)情況。

1.6 胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達(dá)水平檢測 應(yīng)用Western blotting法半定量分析檢測3組大鼠肝組織中胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達(dá)水平，并比較1、2和4周時間點(diǎn)上述3種指標(biāo)動態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)具體步驟：取0.5 g冰凍肝組織置于4℃的組織勻漿緩沖液中勻漿，12 000 r·min-1高速離心15 min，取上清液，樣品的蛋白濃度按Bradford法以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品的蛋白濃度。然后取100 μg總蛋白沸水浴10 min后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，以β-actin為內(nèi)參。電泳結(jié)束后進(jìn)行Western blotting法檢測，應(yīng)用Gel公司的Multi-analyst Software軟件進(jìn)行吸光度(A)值定量分析，結(jié)果以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶A值的比值表示，以確定胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝功能指標(biāo) 第1～4周，模型組大鼠血清中ALT、AST和TB水平高于其他2組(P<0.05)，而阻斷組與對照組上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第2～4周，模型組大鼠血清中ALB和AcSDKP水平低于其他2組(P<0.05)，而阻斷組和對照組上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠肝纖維化指標(biāo) 第1～4周，3組大鼠肝組織中PCⅢ、CⅣ和HA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第2～4周，模型組PCⅢ、CⅣ和HA水平高于其他2組(P<0.05)，而阻斷組和對照組上述各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn) 第1周，各組大鼠肝細(xì)胞和肝組織結(jié)構(gòu)完整、基本正常，無明顯壞死細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生現(xiàn)象。第2周，模型組大鼠肝組織呈現(xiàn)小灶狀壞死，小葉結(jié)構(gòu)基本完整，匯管區(qū)呈現(xiàn)少量纖維增生以及炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞大量發(fā)生脂肪變性；對照組及阻斷組大鼠肝細(xì)胞和肝組織基本正常。第4周，模型組大鼠肝組織呈片狀壞死，肝小葉破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，假小葉，匯管區(qū)擴(kuò)大，較多炎性細(xì)胞浸潤，大量纖維組織增生，肝細(xì)胞脂肪變性程度更加嚴(yán)重；對照組和阻斷組肝細(xì)胞及肝組織基本正常。見圖1(插頁四)。

2.4 各組大鼠肝組織中胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達(dá)水平 第2周開始，模型組大鼠肝組織中胸腺素β4及ACE水平高于其他2組，而POP水平低于其他2組(P<0.05)；阻斷組與對照組上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)及AcSDKP水平

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with blocking group.

表2 各組大鼠肝纖維化指標(biāo)

*P<0.05 compared with control group;△compared with blocking group.

表3 各組大鼠肝組織中胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達(dá)水平

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with blocking group.

3 討 論

近年來AcSDKP在臨床上被廣泛關(guān)注，既往研究[6]顯示：AcSDKP具有較強(qiáng)抑制巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，拮抗成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的作用，因而在體內(nèi)表現(xiàn)出明顯的抗炎及抗纖維化效應(yīng)。研究[7-8, 14-15]證實(shí)：內(nèi)源性AcSDKP生成主要依靠POP分解胸腺素β4產(chǎn)生，而其降解主要依靠ACE分解，這些AcSDKP生成與降解系統(tǒng)均完整地存在于肝內(nèi)。生理學(xué)研究[9, 16]也證實(shí)：AcSDKP在肝內(nèi)濃度接近于心臟和腎臟。動物實(shí)驗(yàn)[7-12]顯示：大鼠心臟組織ACE活性上調(diào)或抑制POP活性，均降低心臟和/或腎臟組織中內(nèi)源性AcSDKP水平，導(dǎo)致心臟纖維化和/或腎小球硬化。實(shí)驗(yàn)動物持續(xù)注射外源性AcSDKP能有效抑制高血壓、心臟缺血再灌注、高血壓腎損害和糖尿病腎損害中出現(xiàn)的靶器官纖維化[10-11, 13-14]。最近研究[12, 15]顯示：AcSDKP能有效介導(dǎo)ACE抑制劑的抗心、腎纖維化效應(yīng)。與在體研究結(jié)果類似，離體研究[13, 16]也顯示：AcSDKP能有效抗心臟成纖細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞的纖維化活性。

雖然AcSDKP在肝內(nèi)的生理作用目前未明確，但是根據(jù)以上相關(guān)研究背景，可以推測內(nèi)源性AcSDKP可能參與對肝臟纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)自穩(wěn)定的調(diào)控[17-18]。最近研究[1,4]顯示：機(jī)體多種器官及組織中廣泛存在胸腺素β4-POP-AcSDKP軸，且發(fā)揮重要生物學(xué)功能。有研究者在膽總管結(jié)扎和四氯化碳注射等大鼠肝纖維化模型中，ACEI(如卡托普利等)已被證實(shí)對肝纖維化有保護(hù)作用，推測其作用機(jī)制可能與上調(diào)AcSDKP有關(guān)[19-20]。但經(jīng)典大鼠肝纖維化模型中內(nèi)源性AcSDKP水平動態(tài)變化及調(diào)控因子(如胸腺素β4、POP和ACE等)改變情況，目前尚無臨床研究進(jìn)行闡述，因此本研究通過選擇膽總管結(jié)扎大鼠肝纖維化模型來探討此病理生理過程[21-23]。

本研究結(jié)果顯示：通過膽總管結(jié)扎制備大鼠肝纖維化模型病理生理模擬程度較好，大鼠的肝功能明顯降低，肝纖維化指標(biāo)明顯升高，病理檢查也支持肝纖維化病理發(fā)生，該病理過程在結(jié)扎膽總管后第2周顯現(xiàn)，這一結(jié)果與既往研究[19-20]結(jié)論相似。而模型組大鼠肝組織中AcSDKP水平也是在第2周明顯降低，與肝纖維化保持同步，證實(shí)內(nèi)源性AcSDKP水平減少會誘導(dǎo)肝臟纖維化發(fā)生。同時模型組大鼠肝組織中POP水平明顯降低、胸腺素β4水平明顯增加，提示內(nèi)源性AcSDKP生成降低；而肝組織中ACE水平明顯升高，提示內(nèi)源性AcSDKP降解增加，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)肝組織內(nèi)源性AcSDKP水平在第2周明顯降低。本研究通過應(yīng)用AcSDKP特異性水解酶阻斷劑ACEI來提高動物模型體內(nèi)的內(nèi)源性AcSDKP水平，結(jié)果顯示：大鼠肝臟纖維化程度明顯改善，這也證實(shí)內(nèi)源性AcSDKP水平降低可能是膽總管結(jié)扎致使大鼠發(fā)生肝纖維化的重要原因之一。

綜上所述，膽總管結(jié)扎大鼠肝纖維化所致內(nèi)源性AcSDKP水平明顯降低有可能是通過Tβ4-POP-AcSDKP軸實(shí)現(xiàn)的，對于Tβ4-POP-AcsDKP軸致使內(nèi)源性AcsDKP缺乏的具體機(jī)制在今后的研究中值得進(jìn)一步探討。