王天月，崔曉燕，吳 驍， 王 丹

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院血液科,遼寧 錦州121001;2.河北省藥品檢驗研究院藥理毒理室,河北 石家莊 050011;3.遼寧何氏醫(yī)學院實驗動物中心,遼寧 沈陽 110163;4. 錦州醫(yī)科大學人體解剖與組織胚胎學教研室,遼寧 錦州121001)

海馬屬邊緣系統(tǒng)，主要包括阿蒙角(Ammon’s horn，CA)和齒狀回 (dentate gyrus, DG)等結構，在空間定位、學習記憶和控制情緒等過程中發(fā)揮著重要作用[1-2]，成為神經(jīng)科學研究的熱點之一。胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族下游成員。無活性的ERK位于細胞質中，當胞外信號引起ERK磷酸化(pERK)激活后，則從細胞質轉位進入細胞核中，從而觸動一系列下游基因的活化[3]。研究[4-6]表明：ERK信號通路激活可直接參與細胞增殖，促進細胞存活，抑制細胞凋亡，促進海馬神經(jīng)細胞增殖,是細胞生長周期環(huán)中不可或缺的過程。近年來，有關ERK的研究多集中在促進細胞增殖及其介導的信號轉導具體機制、建立在各種動物和細胞模型基礎上的關于ERK在神經(jīng)系統(tǒng)退行性與功能失調性疾病以及孤獨癥模型、神經(jīng)毒性和母嬰分離等方面[7-10]；但ERK表達在腦發(fā)育不同階段的變化規(guī)律及其機制研究較少。因此，本研究利用免疫組織化學和免疫印跡法、結合圖像分析技術觀察胚胎 (embryo, E) 18 d以及生后 (postnatal, P) 1、3、7、14、21和28 d時小鼠海馬組織中pERK表達變化，為在分子水平探究海馬發(fā)育機制提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及標本制備[11]8周齡昆明小鼠由錦州醫(yī)科大學動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)2014-0004，以雌雄比例1∶2飼養(yǎng)，按日觀察，見陰道栓出現(xiàn)為E 0 d，仔鼠出生的最早時間為P 0 d。取E 18 d的胎鼠和P 1、3、7、14、21和28 d的小鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備光鏡標本，連續(xù)切片，切片厚度5 μm，用于免疫組織化學顯色。另低溫下取各時間點的小鼠海馬組織，-80℃保存，用于免疫印跡檢測。

1.2 主要試劑 S-P超敏試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗小鼠多克隆pCREB抗體購自美國Santa Cruz 公司，ECL試劑盒購自上海 BestBio公司，蛋白Marker和PVDF膜購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，BCA 試劑盒購自碧云天生物技術研究所，β-actin購自亞太恒信生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟、透明至水化后，滴加過氧化物酶，室溫15 min；高壓修復3 min，室溫冷卻，非免疫動物血清封閉15 min；兔抗小鼠pERK抗體 (1∶100) 4℃孵育過夜；生物素標記的羊抗兔IgG (1∶200)，37℃孵育20 min； 鏈霉素抗生物素-過氧化物酶工作液37℃孵育10 min； DAB-H2O2顯色；蘇木精復染；常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 免疫印跡法檢測小鼠海馬組織中pERK蛋白表達水平 按1∶5比例于海馬組織加入蛋白裂解液，充分反應后離心10 min，采用 BCA 試劑盒檢測上清液蛋白濃度。各泳道加入 50 μg 的蛋白量,電泳分離；冰浴轉膜。轉膜后加入pERK抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；TBST漂洗；加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000)，室溫震蕩孵育 2 h，增強化學發(fā)光法(ECL)檢測蛋白條帶，將條帶掃描后用 Photoshop 7.0 軟件進行處理。內(nèi)參β-actin。掃描X射線片，計算機處理，應用公式計算A值，A值=-lgT，T為透光率，A值越大，表示密度越大，表達水平越高。

1.5 圖像分析 各取5張不同樣本切片，系統(tǒng)、隨機選擇400倍光鏡視野3個，所得圖像結果利用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)進行分析，應用公式計算A值，A=-lgT，T為透光率，A值越大，表示密度越大，表達越強。

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色檢測不同時間點小鼠海馬組織中pERK蛋白表達水平 免疫組織化學檢測結果顯示：pERK陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，主要在海馬DG顆粒細胞層和CA錐體細胞層神經(jīng)元的細胞核中表達。E 18 d，海馬DG和CA區(qū)pERK表達染色淺，排列稀疏，吸光度很低；E 18 d～P 7 d，pERK染色逐漸加深、密集，吸光度逐漸增加，與其他6個時間點比較，P 7 d吸光度最高(F=34.537,P<0.01)。P 14 d～P 21 d，pERK染色逐漸變淺，密集程度逐漸降低，吸光度逐漸下降(F=28.754,P<0.01)；P 28 d處于穩(wěn)定的較低水平(F=6.075,P>0.05)(圖1，見插頁三)。

2.2 免疫印跡法檢測不同時間點小鼠海馬組織中pERK表達水平 免疫印跡法檢測圖像分析結果：各時間點均有pERK表達，E 18 d～P 7 d，pERK表達水平逐漸升高，P 7 d時pERK表達水平最高，與其他6個時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(F=33.856,P<0.01)；P 14～21 d時pERK表達水平逐漸降低，與P 7 d 比較差異有統(tǒng)計學意義(F=22.627,P<0.01)；P 28 d時PERK表達處于穩(wěn)定的較低水平(F=7.421,P>0.05)。見表1。

表1 不同發(fā)育時期小鼠海馬組織DG及CA區(qū)pERK表達的表達水平

Tab.1 Expression levels of pERK in DG and CA regions of hippocampus tissue of mice at different development stages (n=6,±s)

*P<0.01vsthe pre-time point.

3 討 論

海馬結構于胚胎時期發(fā)生，起自位于端腦泡背內(nèi)側，呈 “S”形結構的海馬原基。大鼠海馬原基于E 14 d形成，小鼠則為E 12 d，此后進入海馬的有序發(fā)育過程，即胚胎早、中期速度較慢，于末期和生后早期階段發(fā)育明顯增速，表現(xiàn)為海馬體積以及各層的厚度明顯增加，海馬變成C字形，能區(qū)分CA和DG結構正常大小[12],海馬的這些顯著變化均離不開活躍的細胞增殖活動。

ERK是與細胞增殖有關的重要基因之一，盧瑛等[13]研究發(fā)現(xiàn)：抵抗素能通過上調人血管平滑肌細胞ERK的磷酸化水平，促進平滑肌細胞增殖，應用ERK特異性抑制劑能顯著降低ERK的磷酸化水平，細胞增殖受抑。研究[14-15]顯示：ERK磷酸化后進入細胞核，激活相關轉錄因子，增強轉錄的活性，進而調節(jié)促進細胞周期由G1期向S期過渡的基因表達，包括即刻早期基因和遲發(fā)反應基因，參與細胞分化與增殖的調控。Oliveros等[6]和佟雷等[16]研究發(fā)現(xiàn)：新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖與ERK有關。ERK 信號通路抑制劑可以抑制神經(jīng)細胞自噬，加重蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期腦損傷和急性缺血性腦梗死再灌注損傷[17-19]。

Palmer等[20]認為：成體海馬結構中的神經(jīng)發(fā)生源于齒狀回的亞顆粒細胞層,其位于顆粒細胞層和門區(qū)間的一個狹窄區(qū)域，大多數(shù)神經(jīng)細胞增殖發(fā)生于此。本研究中免疫組織化學結果顯示：pERK主要在DG顆粒細胞層和CA錐體細胞層神經(jīng)元的細胞核中表達，與上述研究結論一致，即pERK主要位于細胞核并參與細胞增殖。

Bayer[21]研究表明：大鼠生后1周為DG增殖分化遷移高峰，P 14 d ～ 2月呈下降趨勢，推測生后1周為大鼠海馬細胞增殖、細胞凋亡和結構構建的關鍵時期。本研究結果顯示：表達pERK的陽性細胞變化趨勢是在E 18 d～P 7 d逐階段增加，P 7 d時達高峰，隨后的P 14～21 d階段 pERK陽性細胞逐漸稀疏，A值降低，P 28 d時處于穩(wěn)定的較低水平。本研究結果表明：pERK的變化趨勢與以往報道的海馬神經(jīng)細胞增殖的變化趨勢的文獻相符[12,21]。出現(xiàn)這種變化趨勢的原因在于：小鼠出生是機體的一大轉折, 外界環(huán)境的聲和光等刺激可能使ERK自身活化，轉入細胞核，進而激活下游轉錄因子，產(chǎn)生細胞增殖效應。發(fā)育早期，即E 18 d～P 7 d，是海馬塑型的關鍵時期，海馬首先形成了DG和CA區(qū)雛形，并且各區(qū)開始分層，為了滿足海馬結構在形態(tài)及體積上出現(xiàn)的巨大改變，必然引起海馬神經(jīng)細胞大量增殖，因此，pERK陽性細胞表達在P 7 d達到最高峰。在海馬結構發(fā)育晚期，即P 14～21 d及以后階段，海馬結構和功能日趨成熟，此時不再需要細胞的大量增殖分化，促使與細胞快速增殖有關的ERK表達逐漸下降，細胞增殖速度放慢，新生細胞數(shù)量逐漸減少，直至P 28 d達穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，pERK參與了海馬神經(jīng)元的增殖，與海馬發(fā)育有關聯(lián)，本研究結果為從分子水平闡明海馬發(fā)育的機制提供了較為詳實的實驗資料。但海馬神經(jīng)細胞增殖受多種因素和多途徑動態(tài)調節(jié)，因此海馬發(fā)育的具體機制還需要進一步的研究。