閻 慧，馬淑飛，段明華，閆玉禮，潘 新，李海清，周長(zhǎng)龍，趙天倚

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.國(guó)藥一心制藥有限公司研發(fā)中心項(xiàng)目管理室，吉林 長(zhǎng)春 130022；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物制藥與保健食品教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117；4.空軍航空大學(xué)飛行訓(xùn)練基地飛行二大隊(duì)，吉林 長(zhǎng)春 130022)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，有明顯的地域性差別。靶向治療可針對(duì)性地殺傷癌細(xì)胞，減輕正常細(xì)胞損害。目前胃癌靶向治療藥物種類及作用均有限。靶向治療藥物主要有表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑、血管生成抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等。京尼平(genipin，GP)的制備方法一般采用從梔子中提取京尼平苷(geniposide)[1]，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空濃縮、重結(jié)晶而制得，也可以采用微生物轉(zhuǎn)化法制備[2]。京尼平苷在杜仲和梔子中含量均較高，達(dá)到3%～8%，但由于梔子栽培容易、產(chǎn)量大，因此GP的生產(chǎn)主要以梔子為原料。GP來(lái)源于京尼平苷，在抗腫瘤、抗血栓、抗炎和治療糖尿病等方面療效顯著，作為一種新興的藥物中間體具有很多新型的、重要的藥理價(jià)值[3]。研究[4-6]表明:GP可有效抑制前列腺癌(AIPC)、腎癌細(xì)胞株(GRC-1)和前列腺癌細(xì)胞(PC-3)的增殖。但目前GP對(duì)胃癌SGC 7901的影響尚不清楚，未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)GP對(duì)SGC 7901細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)SGC 7901細(xì)胞的促凋亡作用，闡明其對(duì)胃癌細(xì)胞抑制和促凋亡機(jī)制，為胃癌的臨床治療提供更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器 胃癌SGC 7901細(xì)胞(湖南豐暉生物)，RPMI培養(yǎng)基、胎牛血清、乙二胺四甲酸(EDTA)、胰蛋白酶、GP和噻唑藍(lán)(MTT)(吉林省金泰生物試劑有限公司)，全蛋白提取試劑盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，PVDF膜(美國(guó)密理博公司)、β-actin、小鼠抗人Bcl-2抗體、小鼠抗人Bax抗體和小鼠抗人caspase-3抗體(美國(guó)BD公司)。Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng) 將細(xì)胞株復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的高糖RPMI 1640培養(yǎng)基放置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，傳代3次后，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組 經(jīng)查閱文獻(xiàn)[7]和預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定GP濃度為10 mg·L-1。將胃癌SGC 7901細(xì)胞分為4組：對(duì)照(DMSO)組，低、中和高劑量(5、10和20 mg·L-1)GP組。

1.4 MTT法檢測(cè)胃癌SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105mL-1，接種于96孔板，接種量為每孔100 μL，培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)基，加入3個(gè)藥物實(shí)驗(yàn)組和DMSO對(duì)照組，每組藥物3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL。放置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48和72 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT(5 μg·L-1)20 μL，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，于離心機(jī)2 500 r·min-1離心15 min，吸盡上清，加入DMSO 150 μL，100 r·min-1振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率 = [1-實(shí)驗(yàn)組A(490)值/對(duì)照組A(490)值] × 100%。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞密度稀釋至2 × 105mL-1，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇MTT作用效果比較明顯的GP濃度，加入細(xì)胞懸浮液中，使藥物終濃度為10和20 mg·L-1。將GP加入RPMI 1640培養(yǎng)基中，使藥物終濃度為10和20 mg·L-1，然后加入胎牛血清，使其濃度為10%。吸取200 μL含有不同濃度(10和20 mg·L-1)GP的細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的不同濃度(10和20 mg·L-1)GP的RPMI 1640培養(yǎng)基800 μL，同時(shí)設(shè)DMSO對(duì)照組，分別培養(yǎng)24、48和72 h后，去掉Transwell小室半透膜，PBS清洗2次，多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦拭去除半透膜上未穿透膜細(xì)胞，PBS清洗3次，普通顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以穿膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.6 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，GP作用于細(xì)胞48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。每孔加入RIPA裂解液100 μL，刮下底部細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液。根據(jù)BCA蛋白測(cè)定試劑盒(全蛋白提取試劑盒)要求，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行樣品蛋白濃度測(cè)定。灌制4%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入Bax、Bcl-2和caspase-3-抗，4℃孵育過(guò)夜，室溫?fù)u床孵育2 h，漂洗3次，分別加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，漂洗3次。取膜，壓片，檢測(cè)，用分析軟件Quanlity One分析目的條帶的相對(duì)灰度值(以β-actin作為內(nèi)參)，以Bax/β-actin表示Bax蛋白表達(dá)水平，以Bcl-2/β-actin表示Bcl-2蛋白表達(dá)水平，以caspase-3/β-actin表示caspase-3蛋白表達(dá)水平[8]。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率 不同濃度GP(5、10和20 mg·L-1)作用于胃癌SGC 7901細(xì)胞 24、48和72 h后，其增殖抑制率均升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈時(shí)間-濃度依賴性。見(jiàn)表1。

表1 各組SGC 7901細(xì)胞增殖抑制率

*P<0.05vscontrol group.

2.2 Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC 7901細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù) 10和20 mg·L-1GP作用于胃癌SGC 7901細(xì)胞后，檢測(cè)穿膜細(xì)胞數(shù)。Transwell小室檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組比較，10和20 mg·L-1GP組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，且呈時(shí)間-濃度依賴性。見(jiàn)圖1(插頁(yè)二)和圖2。

2.3 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平 作用48 h后，與對(duì)照組比較，5、10和20 mg·L-1GP組SGC 7901細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3和4。

3 討 論

癌癥是一種復(fù)雜的疾病，單純的靶向治療并不能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，通過(guò)藥物來(lái)抑制細(xì)胞存活，也會(huì)導(dǎo)致藥效變差，因此尋找能夠調(diào)節(jié)腫瘤生存或凋亡的信號(hào)分子，是治療腫瘤的關(guān)鍵[9]。本研究采用MTT法檢測(cè)GP對(duì)胃癌SGC 7901細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)作用與其濃度和時(shí)間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明：培養(yǎng)24 h，當(dāng)GP濃度為5 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率僅為11.18%，隨著給藥濃度增加和給藥時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用逐漸增強(qiáng)；培養(yǎng)72 h，當(dāng)濃度為20 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)50.56%。本研究中Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，10和20 mg·L-1GP能明顯降低胃癌SGC 7901細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白Bcl-2是最早被發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)的基因[10-11]，也是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。Bax和Bcl-2通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶[12]，使用半胱氨酸裂解的多肽鏈中的硫原子切割caspase-3的活性形式，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。裂解的caspase-3將最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中DNA片段化，因此剪切后的caspase-3是很多化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)增加腫瘤凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)[14]。而caspase-3在caspase家族中被認(rèn)為是最重要的執(zhí)行蛋白，在細(xì)胞死亡過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)caspase-3激活。因此，測(cè)定caspase-3蛋白水平變化[15]，可以研究細(xì)胞凋亡機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度GP(10和20 mg·L-1)作用于胃癌細(xì)胞48 h，檢測(cè)胞內(nèi)Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平[16]，與對(duì)照組比較，GP在低濃度時(shí)就能夠使Bax和caspase-3表達(dá)水平增加，且呈現(xiàn)一定濃度依賴性，而B(niǎo)cl-2蛋白變化與此相反[17]。

*P<0.05 vs control group.

圖2 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)

Fig.2 Number of transmembrane SGC 7901 cells in various groups detected by Transwell chamber assay

Lane 1:Control group;Lane 2-4:5,10,and 20 mg·L-1GP groups.

圖3 Western blotting法檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 proteins in SGC 7901 cells in various groups detected by Western blotting method

*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

圖4 Western blotting法檢測(cè)各組SGC 7901細(xì)胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平

Fig.4 Expression levels of Bcl-2, Bax, and caspase-3 proteins in SGC 7901 cells in various groups detected by Western blotting method

綜上所述，GP能夠上調(diào)Bax和caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果表明：GP對(duì)胃癌SCG 7901細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。