李 軍，姚 靜，王國芳，辛 勤，崔立坤，齊汝霞

(濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院藥理學教研室，山東 濟寧 272067)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱原發(fā)性老年性癡呆癥，是一種以記憶力損害和進行性認知功能障礙為主的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病?；颊吣X組織尤其是海馬區(qū)出現(xiàn)大量老年斑(senile plaques，SP) 是其主要病理學特征之一。大量研究[1-2]證實：β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)是SP的主要毒性成分。Aβ有神經(jīng)毒性，其在腦內(nèi)沉積可引發(fā)一系列的病理反應，如突觸功能異常、神經(jīng)元細胞減少和記憶力損害等。因此，Aβ的產(chǎn)生和清除障礙會導致其在腦內(nèi)過度沉積，被認為是AD最重要的致病因素，因此清除腦內(nèi)Aβ是目前防治AD的重要策略之一[3]。白細胞介素33(interleukin-33，IL-33)是2005年被發(fā)現(xiàn)的一種多功能蛋白質(zhì)，其基因序列和結構與IL-1家族成員IL-18和IL-1β相似，是IL-1家族的一個重要成員[4]。Chapuis等[5]研究發(fā)現(xiàn)：與正常人比較，AD患者腦內(nèi)的IL-33表達水平明顯降低，IL-33表達水平的降低又可明顯增加患AD的風險，同時IL-33能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程減少細胞內(nèi)Aβ的生成。IL-33降低細胞內(nèi)Aβ水平是否與其參與腦內(nèi)Aβ清除過程有關目前尚未見相關報道。本課題組一直致力于IL-33促進腦內(nèi)Aβ清除的研究，本實驗采用皮下注射D-半乳糖和灌胃三氯化鋁(AlCl3)的方法建立AD大鼠模型，觀察IL-33對AD模型大鼠腦內(nèi)Aβ1-40及Ⅱ型輔助性T細胞(Th2)水平的影響，初步探討IL-33在腦內(nèi)Aβ清除過程中的作用及機制，為更好地研發(fā)新的抗AD藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康SD大鼠70只，雄性，體質(zhì)量200～300 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014-0007，標準鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)。D-半乳糖購于上海源聚生物科技有限公司，AlCl3購于天津福晨化學試劑廠，IL-33、Aβ和Th2檢測試劑盒由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。分析天平購于北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司，大鼠跳臺儀購于成都泰盟科技有限公司，Morris水迷宮購于中國醫(yī)學科學院藥物研究所，腦立體定位儀(DW-5)購于成都泰盟科技有限公司，南韓牙科手機(STRANG 90)購于咸陽西北醫(yī)療器械有限公司，勻漿機(IKAR 104)購于上海高鴿工貿(mào)公司，離心機購于北京醫(yī)用離心機廠，Thermo MK3酶標儀購于上海賽默科技生物發(fā)展有限公司。

1.2 實驗動物分組和處理 雄性SD大鼠70只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組，模型組，假手術組，極低、低、中和高劑量IL-33組(0.01、0.10、1.00和10.00 mg·L-1)，每組10只，除正常對照組外，其余各組大鼠均皮下注射D-半乳糖125 mg·kg-1·d-1和灌胃AlCl3500 mg·kg-1·d-1，連續(xù)60 d。正常對照組等量皮下注射生理鹽水和雙蒸水灌胃。

1.3 大鼠跳臺實驗 末次給藥的第2天，將正常對照組和模型組大鼠逐只放入大鼠跳臺箱中，先適應3 min，然后通電5 min(給定電壓為38 V)，使大鼠學習逃避被電擊。24 h后進行記憶測試，以大鼠跳下平臺雙足接觸銅柵為錯誤反應，記錄大鼠5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)和首次出現(xiàn)錯誤的潛伏期。

1.4 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮選用大鼠通用型，水池直徑100 cm，高度40 cm，水深25 cm，水溫22℃～24℃，水中加入豆奶粉，使其呈不透明狀。水迷宮正中放置高度23 cm、直徑8 cm的平臺，沒入水下2 cm，迷宮外參照物保持固定。采用Morris水迷宮實驗進一步判斷大鼠學習記憶能力，實驗方法參照文獻[6]。①定位航行實驗：第1天先讓大鼠自由游泳2 min，第1天第2次即開始訓練，隨后每天訓練4次，每次間隔2 h，共訓練4 d。訓練時選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內(nèi)找到平臺，記錄120 s內(nèi)實際逃避潛伏期；如在120 s內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為120 s。②空間探索實驗：定位航行實驗結束后的次日進行空間探索實驗。撤去平臺，讓大鼠從原平臺象限的對側象限入水，觀察記錄大鼠在原平臺象限停留的時間和游泳的距離，以判斷大鼠記憶存儲及提取再現(xiàn)能力。

1.5 給藥方法 將各劑量IL-33組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 mL·kg-1)進行麻醉后，用DW-5腦立體定位儀固定頭部，頭部剪毛后碘伏消毒，頭顱正中剪開2 cm縱向切口，用刀片刮去骨膜，暴露前囟，用微量進樣器進行前囟零點定位，記錄前后、左右、上下讀數(shù)，于前囟后3 mm，中線左右各旁開2.2 mm，用牙科手機鉆開左右顱骨，針頭消毒，用微量進樣器垂直進針3.3 mm，左右緩慢注射IL-33 1 μL，5 s注入，留針5 min后緩慢拔針，縫合傷口。假手術組大鼠同一位置注射等量生理鹽水做對照。

1.6 腦組織勻漿處理 正常對照組和模型組大鼠斷頸處死，直接取腦組織。其余各組大鼠手術24 h后斷頸處死，立即取腦組織。腦組織用4℃冰冷生理鹽水沖洗，吸干，稱質(zhì)量，冷凍保存。加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)，勻漿機勻漿，3 000 r·min-1離心20 min后，仔細收集上清，準備待測。剩余的腦組織封好后放到冰箱里冷凍待用。

1.7 ELISA法檢測大鼠腦組織中Aβ1-40和Th2 水平 配置濃度分別為600、600、400、400、200、200、100、100、50和50 μg·L-1的10份標準液，參照酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書加樣，顯色，以波長450 nm測定各孔的吸光度(A)值，以標準品濃度為橫坐標，對應A值為縱坐標，繪制標準品線性回歸曲線，計算出標準曲線的線性回歸方程式，將樣品的A值代入方程，計算出樣品，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際水平，即Aβ水平，單位：μg·L-1。將腦組織從冰箱里取出后反復凍融，用勻漿機依次勻漿，3 000 r·min-1常溫高速離心，離心后取上清液備用。按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒的說明書操作，應用Thermo MK3酶標儀測定大鼠腦組織內(nèi)細胞因子Th2水平并記錄數(shù)據(jù)。測定方法同Aβ，單位：μg·L-1。

2 結 果

2.1 2組大鼠跳臺實驗中錯誤次數(shù)和潛伏期 與正常對照組比較，模型組大鼠在跳臺實驗中的錯誤次數(shù)增多(t=8.154，P<0.01)，潛伏期明顯縮短(t=4.579，P<0.01)。見表1。

表1 2組大鼠跳臺實驗中潛伏期和錯誤次數(shù)

Tab.1 Latencies and mistake times of rats in step down test in two groups (n=10,±s)

*P<0.01 compared with normal control group.

2.2 2組大鼠Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期 在定位航行實驗中，2組大鼠逃避潛伏期隨著訓練時間的延長逐漸縮短，第1～4天，模型組大鼠逃避潛伏期較正常對照組明顯延長(t=27.810，P<0.01；t=17.731，P<0.01；t=30.961，P<0.01；t=25.159，P<0.01)。見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠在目標象限內(nèi)滯留時間和游泳距離明顯縮短(t=3.767，P<0.01；t=1.973，P<0.05)。見表3。

表2 2組大鼠水迷宮實驗中逃避潛伏期

*P<0.01 compared with normal control group.

表3 2組大鼠水迷宮實驗中目標象限停留時間和游泳距離

Tab.3 Resident time in target quadrant and swimming distance of rats in Morris water maze test in two groups (n=10,±s)

*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group.

2.3 各組大鼠腦組織中Aβ1-40和Th2水平 與正常對照組比較，模型組大鼠腦組織中Aβ水平明顯升高(t=3.222，P<0.05)。低、中和高劑量IL-33組大鼠腦組織中Aβ水平較模型組明顯降低(F=9.866，P<0.05)，極低劑量IL-33組和假手術組大鼠腦組織中Aβ水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=8.527，P>0.05；t=2.028，P>0.05)。見表4。IL-33量效之間基本符合正態(tài)分布。

與正常對照組比較，模型組大鼠腦組織中的Th2水平明顯降低(t=4.646，P<0.01)。與模型組比較，給藥組大鼠腦組織中的Th2水平明顯升高(F=3.620，P<0.05)，極低劑量IL-33組和假手術組大鼠腦組織中的Th2濃度與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.459，P>0.05；t=0.326，P>0.05)。見表4。IL-33量效之間基本符合正態(tài)分布。

表4 各組大鼠腦組織中Aβ1-40 Th2水平

*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

3 討 論

D-半乳糖可導致大鼠亞急性衰老，大量D-半乳糖進入動物體內(nèi)，在半乳糖氧化酶的催化下，代謝為CO2和木酮糖，同時產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基(O2-)，過量的自由基在動物體內(nèi)不僅損害生物膜系統(tǒng)，還影響核酸和蛋白質(zhì)的代謝，加重細胞損傷，短期內(nèi)可導致大鼠機體多器官、多系統(tǒng)功能衰退，同時也可引起大腦神經(jīng)元的一系列退行性改變[7]。研究[8-9]表明：AD患者腦組織中鋁水平是正常人的20～30倍，過量的鋁在腦組織中蓄積可參與神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)和SP的形成，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。D-半乳糖和AlCl3可在基因水平調(diào)控淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和β-內(nèi)分泌酶基因，使其表達水平增加，導致Aβ在腦組織過度沉積[10]。本研究行為學檢測結果顯示：模型組大鼠在跳臺實驗中錯誤次數(shù)明顯增多，潛伏期明顯縮短；在Morris水迷宮實驗中，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，在目標象限停留時間和游泳距離明顯縮短，表明模型組大鼠的記憶已出現(xiàn)障礙，學習記憶能力明顯下降。通過測定大鼠腦組織內(nèi)Aβ濃度顯示：模型組大鼠腦組織內(nèi)Aβ水平較正常對照組明顯升高。以上結果提示：本研究實驗動物模型已經(jīng)造模成功，D-半乳糖聯(lián)合AlCl3制作的AD大鼠模型較好地模擬了AD患者學習記憶障礙和病理學方面的特征，是目前篩選AD治療藥物靶點的一種較為理想的動物模型。

β-淀粉樣前體蛋白(amybid precursor protein，APP)是一種在多組織細胞中表達的跨膜糖蛋白，尤以腦組織中水平最高。在正常的生理條件下，APP主要經(jīng)α-分泌酶和γ-分泌酶剪切產(chǎn)生可溶的P3肽段和APP細胞內(nèi)結構域(APP intracellular domain，AICD)，不產(chǎn)生Aβ，只有少量的APP經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切產(chǎn)生Aβ。而病理狀態(tài)下β-分泌酶基因會過度表達，促使 APP 更多地經(jīng)β-分泌酶途徑代謝形成Aβ，凝聚狀態(tài)的Aβ會迅速在神經(jīng)元之間集聚，形成SP[11]。SP具有神經(jīng)毒性作用，可導致神經(jīng)元細胞功能紊亂甚至凋亡壞死，誘發(fā)或加重老年性癡呆。

Aβ是AD重要的致病物質(zhì)，研究[12]顯示：AD患者腦內(nèi) IL-33表達水平明顯低于正常人。此外，IL-33可降低神經(jīng)細胞分泌的Aβ，IL-33對于AD可能是一個神經(jīng)保護因子。IL-33可能通過增強神經(jīng)膠質(zhì)細胞吞噬Aβ，即通過增加對Aβ的清除來保護大腦神經(jīng)元免受損傷[13]。本研究中ELISA法檢測結果顯示：模型組大鼠腦組織中Aβ水平較正常對照組明顯升高，低、中和高劑量IL-33 組大鼠腦組織中Aβ濃度較模型組明顯降低，與以上研究結果相符，也在一定程度上證明了上述觀點。

正常情況下，神經(jīng)膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞都可以吞噬Aβ[14-15]，Aβ在其中加工后，與MHC分子相互識別，激活Th0，提高Th2細胞因子的表達水平，使得Th2生成增多。然后，B細胞在IL-4和Th2協(xié)助下活化產(chǎn)生特異性抗體并與可溶性Aβ結合后，促進Aβ降解[16]。研究者[17-18]發(fā)現(xiàn)：IL-33對于Th2的免疫應答具有十分重要的作用，其通過作用于Th2細胞ST2受體增強Th2免疫應答能力，增加Th2的生成，從而促進B細胞活化產(chǎn)生特異性抗體降解Aβ。本研究中ELISA法檢測結果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠腦內(nèi)的Th2水平明顯降低，低、中和高劑量IL-33組大鼠腦內(nèi)的Th2水平較模型組明顯升高，但極低劑量IL-33組和模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。本研究結果表明：IL-33可能通過增強Th2免疫應答能力產(chǎn)生特異性抗體來增加腦內(nèi)Aβ的清除而發(fā)揮抗AD作用，但其具體機制還需進一步研究。