于 洋，徐 路，劉師兵，李松巖，徐 冶

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤靶向治療與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

楊梅素是提取于楊梅科楊梅屬植物楊梅果實(shí)的一種酮類化合物。植物黃酮類均具有較強(qiáng)的抗氧化活性[1-2]，使其具有一定抑菌作用[3-4]、免疫因子激活作用[5-6]和抗衰老作用[7-8]等生物學(xué)活性；曾有研究者[9]對(duì)楊梅素的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用作出過(guò)相應(yīng)報(bào)道，但具體機(jī)制尚不十分明確。線粒體功能的維持是細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要保證，線粒體動(dòng)力學(xué)是目前針對(duì)于線粒體功能研究的焦點(diǎn)之一，主要包括內(nèi)外線粒體膜的融合和分裂，這個(gè)相反的過(guò)程有助于維持線粒體的正常生理功能[10-11]。線粒體過(guò)度融合常導(dǎo)致巨型線粒體的產(chǎn)生，常見(jiàn)于病變肝細(xì)胞或營(yíng)養(yǎng)不良患者胰腺細(xì)胞等[12]；反之，若線粒體過(guò)度分裂，則會(huì)導(dǎo)致線粒體形成碎片，使線粒體部分或完全喪失基本功能，誘發(fā)線粒體自噬甚至導(dǎo)致線粒體途徑凋亡的發(fā)生[13]。卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖腫瘤第3位，目前已成為女性生殖腫瘤致死的首要病因[14]。在臨床化療過(guò)程中出現(xiàn)的不同程度腫瘤耐藥促使人們找尋更為低毒高效的生物制劑或化學(xué)藥物來(lái)抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞。本課題組前期研究[15]顯示：楊梅素對(duì)于人卵巢癌細(xì)胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以楊梅素作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，結(jié)合特異性動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin related protein 1, DRP1)抑制劑—mdivi/1，觀察楊梅素誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞株凋亡過(guò)程中線粒體分裂情況，探討楊梅素抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 SKOV3細(xì)胞由吉林大學(xué)病理生理學(xué)系惠贈(zèng)。Muse○R細(xì)胞狀態(tài)分析儀凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Muse○R試劑公司，所有一抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，新生牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco○R公司，二抗及其他試劑購(gòu)于北京鼎國(guó)生物試劑公司。860型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光儀，中國(guó)上海天能科技有限公司；FV1000型共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；Muse○R細(xì)胞狀態(tài)分析儀，美國(guó)默克密理博公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 SKOV3細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清的1640培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2～3 d傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、mdivi-1組、楊梅素組和聯(lián)合給藥組，對(duì)照組不做干預(yù)，mdivi-1組以50 μmol·L-1mdivi-1作用1 h后更換含細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)23 h，楊梅素組以50 g·L-1楊梅素作用24 h，聯(lián)合給藥組以50 μmol·L-1mdivi-1作用1 h后更換含50 g·L-1楊梅素的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)23 h。

1.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率 先將細(xì)胞接種至96孔板，按1.2中分組方法進(jìn)行分組及給藥處理24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。最后以酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。 細(xì)胞存活率 =(給藥組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.5 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 按1.2中分組方法分組并干預(yù)SKOV3細(xì)胞，以胰蛋白酶消化離心收集全部細(xì)胞，收集后的每管細(xì)胞加入120 μL RIPA細(xì)胞裂解液，混勻后，冰浴下用細(xì)胞超聲粉碎儀超聲粉碎2次，每次5～10 s，放入4℃冰箱45 min，充分裂解細(xì)胞。離心，收集上清液，以96孔板蛋白定量后，所余部分上清液與5×SDS Loading緩沖液按4︰1體積比混勻后進(jìn)行蛋白變性。變性后的蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件：濃縮膠100 V、30 min、分離膠200 V、60 min，電泳結(jié)束后，利用濕轉(zhuǎn)法將膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜用5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，PBST洗3次，加入以一抗稀釋液200倍稀釋后的檢測(cè)目標(biāo)一抗，分別為：β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3，caspase3)、動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin related protein 1，DRP1)和分裂蛋白1(fission 1，F(xiàn)IS1)，4℃孵育過(guò)夜。次日PBST洗3次，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1︰1 000稀釋)，室溫下?lián)u床搖1 h，PBST洗3次，ECL發(fā)光并拍照，以β-actin作為內(nèi)參照對(duì)各組蛋白表達(dá)變化灰度進(jìn)行對(duì)比分析，并對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。蛋白表達(dá)水平=每個(gè)樣本條帶灰度值/β-actin灰度值。

1.6 MitoTracker○RRed觀察線粒體形態(tài) 按1.2中分組方法進(jìn)行分組及給藥處理，制備細(xì)胞爬片后，以MitoTracker○RRed 250 μmol·L-1，37℃孵育30 min；以Hoechst 33342 染核2 min后，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞存活率 與對(duì)照組(100%)比較，mdivi-1組細(xì)胞存活率(97.28%±4.12%)無(wú)明顯降低(P>0.05)，楊梅素組細(xì)胞存活率(52.17%±6.28%)明顯降低(P<0.05)，而聯(lián)合給藥組細(xì)胞存活率(63.87%±5.68%)明顯高于楊梅素組(P<0.05)。

2.2 各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡率 與對(duì)照組[細(xì)胞凋亡率(5.89%±1.12%)]比較，mdivi-1組細(xì)胞凋亡率(5.99%±2.28%)無(wú)明顯變化(P>0.05)，楊梅素組細(xì)胞凋亡率(45.35%±5.38%)升高(P<0.05)，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率(32.62%±4.47%)低于楊梅素組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A:Control group;B:Mdivi-1 group;C:Myricetin group;D:Combined group.

2.3 各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，楊梅素組細(xì)胞中Cyt C和caspase3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥組細(xì)胞中Cyt C和caspase3蛋白表達(dá)水平較楊梅素組均明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞線粒體分裂情況 經(jīng)MitoTracker○RRed熒光探針特異性標(biāo)記線粒體后激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體分裂情況，結(jié)果顯示：mdivi-1組細(xì)胞中線粒體熒光染色表現(xiàn)與對(duì)照組基本一致；楊梅素組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光增強(qiáng)，且較對(duì)照組線粒體的條索樣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯粗糙砂礫樣改變，說(shuō)明楊梅素組細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂趨勢(shì)較對(duì)照組增強(qiáng)；與楊梅素組比較，聯(lián)合給藥組細(xì)胞中線粒體熒光染色砂礫感下降，亮度減弱，說(shuō)明線粒體分裂程度下降。見(jiàn)圖3(插頁(yè)一)。

Lane 1:Control group; Lane 2:Mdivi-1 group; Lane 3:Myricetin group; Lane 4:Combined group.*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmyricetin group.

圖2 各組SKOV3細(xì)胞中Cyt C和caspase3蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.2 Electrophorogram(A) and histogram(B) of expressions of Cyt C and caspase3 proteins in SKOV3 cells in various groups

2.5 各組人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中線粒體分裂相關(guān)蛋白表達(dá)水平 Western blotting 結(jié)果顯示：楊梅素組細(xì)胞中DRP1和FIS1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，而聯(lián)合用藥組DRP1和FIS1表達(dá)水平較楊梅素組均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

Lane 1:Control group; Lane 2:Mdivi-1 group; Lane 3:Myricetin group; Lane 4:Combined group.*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmyricetin group.

圖4 各組SKOV3細(xì)胞中DRP1和FIS1蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.4 Electrophorogram(A) and histogram(B) of expressions of DRP1 and FIS1 proteins in SKOV3 cells in various groups

3 討 論

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，其參與能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等眾多生理病理學(xué)過(guò)程。線粒體具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且由于線粒體的分裂和融合，致使該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)長(zhǎng)期處于動(dòng)態(tài)變化中。新近研究[16]證實(shí)：線粒體分裂是細(xì)胞凋亡過(guò)程早期發(fā)生的細(xì)胞器形態(tài)改變，而線粒體融合則對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡有抑制作用[17]。線粒體分裂和融合過(guò)程受多種蛋白的精確調(diào)控，線粒體分裂對(duì)外界刺激和代謝信號(hào)高度敏感。研究[18-19]表明：多種信號(hào)通路和大量信號(hào)分子參與該過(guò)程。DRP1是調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂的關(guān)鍵蛋白，正常情況下其主要定位于細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)過(guò)裂變信號(hào)刺激，DRP1轉(zhuǎn)移到線粒體，與FIS1結(jié)合共同參與線粒體分裂過(guò)程[13]。本研究將楊梅素作用于人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，結(jié)果顯示：楊梅素具有明顯降低細(xì)胞存活率和凋亡誘導(dǎo)作用，Cyt C和caspase3表達(dá)水平變化提示該凋亡與線粒體功能有密切關(guān)聯(lián)，線粒體熒光探針和DRP1、FIS1蛋白表達(dá)水平變化也提示楊梅素組SKOV3細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂明顯增強(qiáng)。為了進(jìn)一步明確楊梅素所誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制及與線粒體分裂之間的關(guān)系，本研究進(jìn)一步引入mdivi-1，通過(guò)抑制DRP1功能抑制線粒體分裂[20-22]，將其與楊梅素聯(lián)用后，楊梅素的凋亡誘導(dǎo)作用明顯受到抑制，說(shuō)明楊梅素該作用是DRP1依賴性的，楊梅素很可能通過(guò)上調(diào)DRP1表達(dá)來(lái)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞線粒體分裂從而發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果在相關(guān)楊梅素抗癌作用的研究中是較為新穎的發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)類似報(bào)道。本研究結(jié)果對(duì)完善楊梅素及其同類衍生物抗癌作用的機(jī)制具有一定意義，也為新型低毒高效抗腫瘤藥物的研發(fā)提供參考。