孟 琳，王 璐，布文奐，丁鑫鑫，高華麗，王梓霖，劉玉蘭，李 琛，孫宏晨

(1. 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021；2. 吉林大學口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021；3. 吉林大學口腔醫(yī)院種植科，吉林 長春 130021；4. 吉林大學口腔醫(yī)院兒童口腔科， 吉林 長春 130021；5. 吉林大學口腔醫(yī)院口腔黏膜病科，吉林 長春 130021)

口腔癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤,以鱗狀細胞癌為主,每年約有50萬新增病例,尤其是舌鱗癌患者可并發(fā)有不同程度的局部復發(fā)及遠處轉移,一般預后較差[1]。腫瘤的發(fā)生與遺傳和表觀遺傳學有關，而近年來有研究[2]顯示：腫瘤的發(fā)生發(fā)展也與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)密切相關,免疫細胞、微血管、基底膜、腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAF)和細胞外基質圍繞腫瘤細胞構成TME。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作為成人多能干細胞引起了研究者的興趣，有文獻[3]報道：BMSCs可以歸巢到TME從而調(diào)節(jié)其穩(wěn)態(tài)和免疫。然而近年來研究報道BMSCs對腫瘤的影響尚無定論，有文獻[4-7]報道：BMSCs促進腫瘤發(fā)展，如促進乳腺癌增殖，通過Hedgehog信號通路促進骨肉瘤和胃癌增殖；BMSCs抑制肺癌和惡性膠質瘤發(fā)展。除此之外，對同一腫瘤BMSCs也會通過不同的通路產(chǎn)生截然相反的作用，例如BMSCs可以通過分泌IL-6促進肝細胞癌增殖[8]，也通過MAPK通路抑制肝細胞癌增殖[9]。目前舌鱗狀細胞癌與BMSCs的相互作用鮮有報道。本研究從小鼠骨髓中提取小鼠骨髓間充質干細胞(mBMSCs)，并探討舌鱗狀細胞癌Cal27細胞和mBMSCs的關系，為闡明其作用機制奠定基礎，為腫瘤治療的發(fā)展提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器 4～6周齡C57BL/6雄性小鼠，購自吉林大學動物實驗中心，動物合格證號:SCXK(吉)2015-0003。人舌鱗癌細胞系Cal27和人正?？谇簧掀ぜ毎礖acat(中國科學院細胞庫)。H-DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈雙抗和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，F(xiàn)ITC 標記抗小鼠/人CD11b、FITC 標記抗小鼠/大鼠CD29、PE標記抗小鼠/人 CD44、APC 標記抗小鼠Ly-6A/E (Sca-1)和FITC 標記抗小鼠CD45(美國Biolegend公司)。8.0 μm孔徑 Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)、 24孔板，0.4 μm孔徑 Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)、 6孔板(美國Costar公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2，飽和濕度。Cal27和Hacat細胞于H-DMEM(含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗)常規(guī)培養(yǎng)。 每隔3 d換液，并根據(jù)細胞的生長情況用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 mBMSCs分離和培養(yǎng) 選取4～6周齡C57BL/6型雄性小鼠10只，體質量為15～20 g，采用脊髓脫臼法處死，70%酒精噴灑小鼠背部消毒，持止血鉗從背部中央開始分離皮膚，直至露出后肢；取出雙側后肢，切下恥股關節(jié)和掌趾關節(jié)后，將股骨和脛骨放于70%酒精數(shù)秒后轉至無菌PBS；在超凈臺內(nèi)分離股骨和脛骨，盡可能將肌肉等軟組織去凈，盡快取出股骨和脛骨用25號針頭將完全培養(yǎng)基沖出骨髓至100 mm培養(yǎng)皿，加入10 mL α-MEM(含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗),放于恒溫孵箱培養(yǎng)5～7 d，每2 d換1次液，細胞長至80%融合時傳代，傳至P2代進行實驗，獲得mBMSCs，應用倒置相差顯微鏡和光學顯微鏡觀察。

1.4 流式細胞術鑒定mBMSCs表面抗原 將第2代mBMSCs消化后收獲細胞,用抗CD11b、CD29、CD44、Sca-1和CD45抗體室溫反應30 min, PBS洗滌2次后懸于PBS中,采用流式細胞術檢測各抗體陽性率。

1.5 Transwell 趨化實驗 條件培養(yǎng)基的獲取：將Cal27和Hacat細胞以每孔2×105個細胞接種于6孔板，將培養(yǎng)24 h后的細胞培養(yǎng)液采用0.22 μm濾膜抽濾去除死細胞及細胞碎片后獲得相應細胞的條件培養(yǎng)基。將mBMSCs消化，使用無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，每個小室中加入200 μL，使細胞數(shù)為5 000個。下室中加入600 μL的α-MEM完全培養(yǎng)基作為空白對照組，Cal27細胞實驗組加入等量Cal27細胞的條件培養(yǎng)基，Hacat細胞對照組加入等量Hacat細胞條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件一致；24 h后去除上室培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌2次，1%結晶紫染色15 min，PBS洗滌2次，用棉棒擦掉上室中的細胞，于熒光倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個清晰視野，拍照，計數(shù)每個視野下穿膜細胞數(shù)(個)。

1.6 舌鱗癌Cal27細胞與mBMSCs共培養(yǎng) Cal27細胞消化后以每孔3×105個細胞接種于6孔板內(nèi)，24 h后待Cal27細胞貼壁后，放入0.4 μm規(guī)格的Transwell小室至上述6孔板中；上室加入消化后的mBMSCs細胞懸液200 μL，細胞密度為1×104個細胞/孔，放入孵箱培養(yǎng)24 h后進行實驗，對照組為未共培養(yǎng)的Cal27細胞。

1.7 細胞增殖實驗 以未共培養(yǎng)的Cal27細胞為單純Cal27細胞對照組，以上述共培養(yǎng)的Cal27細胞為實驗組(共培養(yǎng)組)。將2組細胞消化后接種于24孔板，每孔2×104個細胞，每組設3個復孔，設時間點分別為1、2、3、4、5、6和7 d。每24 h消化一組時間點細胞進行細胞計數(shù)，每孔重復3次取平均值。繪制增殖曲線。

1.8 克隆形成實驗 以未共培養(yǎng)的Cal27細胞為單純Cal27細胞對照組，以上述共培養(yǎng)的Cal27細胞為實驗組(共培養(yǎng)組)。2組細胞消化后以每皿1 000個細胞的密度接種于60 mm的細胞培養(yǎng)皿中，搖勻。于孵箱中培養(yǎng)1～2周，共培養(yǎng)組每隔2～3 d補加200 μL mBMSCs條件培養(yǎng)基，單純Cal27細胞對照組加等量PBS；當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，倒置顯微鏡照相，觀察克隆形成是否達到標準(克隆細胞數(shù)>300個)；棄上清液，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌2次，1%結晶紫染色15 min，洗去染色液，空氣干燥，掃描。

1.9 Transwell遷移實驗 將單純Cal27細胞對照組和共培養(yǎng)組細胞分別消化，使用無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，采用8 μm Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)，每個小室中加入200 μL，使細胞數(shù)目為1×104個。下室中加入600 μL的10%FBS,培養(yǎng)條件一致；24 h后去除上室培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌2次，1%結晶紫染色15 min，PBS洗滌2次，用棉棒擦掉上室中的細胞，于熒光倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個清晰視野，拍照，計數(shù)每個視野下穿膜細胞數(shù)(個)。

2 結 果

2.1 mBMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)反復貼壁法純化后的mBMSCs傳代培養(yǎng)至第2代，形態(tài)穩(wěn)定，倒置顯微鏡觀察：mBMSCs多數(shù)細胞呈短梭形，細胞質豐富，細胞核呈橢圓形或腎形，細胞突長短不一，細胞排列整齊(圖1)。采用流式細胞術檢測培養(yǎng)第2代的mBMSCs細胞表型結果：mBMSCs特異性抗原高表達APC 標記的 Ly-6A/E(Sca-1)(87.62%)，PE 標記的 CD44(77.84%)，F(xiàn)ITC標記的CD29(90.73%)，造血系抗原低表達FITC 標記的CD45(0.02%) 和FITC標記的CD11b(0.04%)(圖2)。

2.2 各組歸巢至單純Cal27細胞mBMSCs數(shù)目 Transwell趨化實驗：空白對照組趨化的mBMSCs細胞數(shù)稀少；Hacat細胞對照組Hacat細胞募集的mBMSCs細胞數(shù)較少；與空白對照組(1.60±0.51)及Hacat細胞對照組(11.80±1.56)比較，Ca127細胞實驗組Cal27細胞募集的mBMSCs細胞數(shù)(59.00±2.78)明顯增加(P<0.01)(圖3，見插頁一)。

A：P0 mBMSCs；B：P1 mBMSCs；C：P2 mBMSCs.

Fig.1 Morphology of mBMSCs under light microscope(×100)

A:Sca-1;B:CD44;C:CD29;D:CD45;E:CD11b.

2.3 2組Cal27細胞的增殖曲線和克隆形成 mBMSCs和Cal27細胞共培養(yǎng)后，與單純Cal27細胞對照組比較，5、6和7 d時共培養(yǎng)組細胞數(shù)明顯升高(P<0.01)(圖4)?？寺⌒纬蓪嶒灒虹R下克隆細胞數(shù)均大于300，為有效克隆群(圖5A，見插頁一)；共培養(yǎng)組co-Cal27細胞克隆數(shù)明顯增多，且克隆細胞團較豐富(圖5B，見插頁一)，與單純Cal27細胞對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.4 2組Cal27細胞的遷移數(shù) 單純Cal27對照組Cal27細胞遷移至小室下表面的數(shù)量為(29.00±2.24)個，共培養(yǎng)組Cal27細胞遷移到小室下表面的數(shù)量為(62.00±8.25)個，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明co-Cal27細胞遷移能力明顯增強。見圖6(插頁一)。

圖4 Cal27細胞增殖情況

(n=3,±s)

*P<0.01 compared with single Cal27 cell control group.

3 討 論

口腔鱗癌尤其是舌鱗癌在臨床上廣泛可見，因其常發(fā)生復發(fā)和淋巴結轉移而導致患者遠期生存率降低，目前常規(guī)的治療方法為手術切除，或合用放化療法[10]。因此，探討舌鱗癌的發(fā)展遷移過程變得非常重要，可為未來根治舌鱗癌提供思路。腫瘤的發(fā)展不僅與腫瘤實質細胞有關，還與腫瘤生存的環(huán)境，即TME有密切關聯(lián)，而在TME中存在多種基質細胞成分，其中間質成分占有很大的比例，發(fā)揮了重要的作用，可以增強或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究[11]顯示：舌鱗癌中存在豐富的CAFs，而且CAFs具有異質性，并已證實CAF部分來源于正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)：胃癌細胞通過miR-155-5p-NF-κB信號通路將BMSC轉化為CAF。本文作者推測：舌鱗癌CAFs的另一來源可能是BMSCs。探討B(tài)MSCs與舌鱗癌的相互作用及其機制可以尋找在這一過程中可能存在的抗腫瘤靶點，為未來抗腫瘤藥物的靶向治療奠定基礎。

本研究采用全骨髓法獲得mBMSCs，并采用反復貼壁法純化將其至P2代(圖1)，流式細胞術測定多個表面標記鑒定mBMSCs，即Sca-1、CD44、CD29、CD45和 CD11b，證實為mBMSCs。歸巢是指內(nèi)源性的或外源性的細胞在多種因素的作用下穿過內(nèi)皮細胞定向遷移至靶向組織血管并定植的過程[13], Xie等[14]分別在健康小鼠、肝細胞癌皮下荷瘤小鼠模型、肝細胞癌原位移植小鼠模型和肺轉移癌小鼠模型中對比了尾靜脈注射mBMSCs后其歸巢情況，結果顯示：mBMSCs明顯快速歸巢至TME，首先出現(xiàn)在微小癌細胞灶處。這一歸巢過程需要包括趨化因子、生長因子和黏附因子等細胞因子的調(diào)控，如肝細胞癌通過CCL15與BMSCs上的受體CCR1結合后可促進BMSCs歸巢至腫瘤微環(huán)境[15]。有研究[16-17]報道：癌細胞能夠促進BMSC增殖并惡變。本研究中體外細胞趨化實驗顯示：mBMSCs同樣對人舌鱗癌Cal27細胞存在較正常上皮Hacat細胞更明顯的歸巢行為，表明Cal27細胞促進mBMSCs的歸巢。

BMSCs歸巢至TME后對癌細胞產(chǎn)生的作用是兩方面的[18-20]：一方面可以快速歸巢至TME并具有多向分化潛能，可以作為一種新興的細胞載體，如Lang等[21]等用BMSCs裝載分泌miR-124a的外泌體治療惡性神經(jīng)膠質瘤取得良好的治療效果；另一方面BMSCs若促進癌細胞發(fā)展，那么探討其促癌機制以尋求一種有效的抗癌靶點，達到同時殺傷癌細胞和腫瘤基質細胞的共同治療，如Camorani等[22]通過拮抗血小板源性生長因子受體β(PDGFR-β)而抑制BMSCs歸巢至TME達到治療乳腺癌的目的。本研究中將mBMSCs和舌鱗癌Cal27細胞共培養(yǎng)結果顯示：共培養(yǎng)后Cal27細胞的增殖、遷移能力明顯提高，說明mBMSCs促進舌鱗癌發(fā)展，因此可以將針對mBMSCs歸巢中的主要細胞因子或促癌的主要機制作為抗癌藥物的治療靶點，抑制mBMSCs的歸巢作用。

本研究的不足之處在于采用mBMSCs而未使用hBMSCs，這是由于本研究擬采用裸鼠移植瘤模型進行體內(nèi)歸巢實驗，使用mBMSCs這種同種異源細胞能更好地模擬BMSCs在體內(nèi)的循環(huán)，減少不同種屬細胞間的排斥反應。有文獻[23]報道：在前列腺癌中，小鼠和人的前列腺癌均分泌CXCL16作用于小鼠和人BMSCs的CXCR6，其實驗結果是一致的；Chen等[24]曾采用小鼠巨噬細胞系RAW264.7與人肝癌細胞系共培養(yǎng)來探討巨噬細胞與肝癌的關系。本課題組將在機制方面的研究中對于小鼠和人的BMSCs是否具有一致性進行更深入探討。

綜上所述，本研究成功分離并培養(yǎng)了mBMSCs，發(fā)現(xiàn)舌鱗癌促進mBMSCs歸巢至TME并促進舌鱗癌增殖和浸潤，與歸巢作用可能相關的細胞因子和BMSCs促進舌鱗癌發(fā)展的具體機制是接下來研究的重點。