李繼紅, 鄧潔華, 趙宜樂, 王剛生

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院, 河北 石家莊 050000)

近年來，系統(tǒng)性假絲酵母菌感染發(fā)病率呈升高趨勢，多數(shù)由白假絲酵母菌(Candidaalbicans)引起，其病死率高達(dá)40%以上，故引起臨床廣泛關(guān)注[1]。目前對系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的發(fā)病機制研究尚不清楚，藥物治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床需求；通過建立系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的動物模型，不但能從整體上探討白假絲酵母菌感染的致病機制，且對研究新型抗真菌藥物的體內(nèi)藥效具有重要的意義[2]。動物模型具有體外實驗不可比擬的優(yōu)勢，可在整體上模擬病源與宿主間的復(fù)雜關(guān)系[3]。故本實驗采用BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺造成小鼠免疫抑制后，再經(jīng)腹腔注射白假絲酵母菌建立系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的生物指標(biāo)模型?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與動物 白假絲酵母菌(ATCC 90028)由中國科學(xué)院微生物研究所提供，經(jīng)動物實驗提取致病菌株；菌株采用Vitek2 YST(由法國生物梅里埃公司提供)進(jìn)行鑒定。雄性BALB/c小鼠6～8 W，體重22～25 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥物與試劑 環(huán)磷酰胺由江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司提供，(1, 3)-β-D-葡聚糖試劑盒由湛江安度斯生物有限公司提供，LKM型動態(tài)試管檢測儀由Lad Kinetics Ltd公司提供。BECKMAN COULTER HMX全自動五分類血細(xì)胞分析儀由美國Beckman Coulter公司提供。

1.1.3 實驗地點 動物實驗地點為河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)條件為IVR層流柜、溫度22 ℃、濕度50%～70%。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立免疫抑制小鼠模型的方法 40只BALB/c小鼠隨機分為免疫抑制組(30只)和免疫抑制對照組(10只)。免疫抑制組小鼠經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(200 mg/kg·d)，連續(xù)2 d；在用藥前1 d及用藥后第2、4、6、8天，取小鼠尾靜脈血，采用BECKMAN COULTER HMX全自動五分類血細(xì)胞分析儀進(jìn)行白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)，同時觀察小鼠生活狀態(tài)。免疫抑制對照組小鼠經(jīng)腹腔注射0.9%生理鹽水0.25 mL，1次/d，連續(xù)2 d。

1.2.2 建立白假絲酵母菌感染模型的方法 60只BALB/c小鼠隨機分為感染組(30只)和對照組(30只)。感染組小鼠經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(200 mg/kg·d，連續(xù)2 d)，在用藥第3天時，經(jīng)腹腔注射白假絲酵母菌0.25 mL(濃度為1×107CFU/mL)，分別對注射真菌后第2～14天死亡小鼠以及第14天存活小鼠(采取頸椎脫臼法處死)進(jìn)行解剖，即刻取小鼠組織進(jìn)行真菌鏡檢、培養(yǎng)和病理檢查，同時對肺、腎組織進(jìn)行(1, 3)-β-D-葡聚糖測定。對照組小鼠經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(200 mg/kg·d，連續(xù)2 d)，在用藥第3天時，經(jīng)腹腔注射0.9%生理鹽水0.25 mL。

1.2.3 菌懸液制備 將白假絲酵母菌(ATCC 90028)制備成1×107CFU/mL菌懸液，以0.25 mL注射到免疫抑制組用藥第3天的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，于注射真菌菌懸液后第7天取腎組織置于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)，37℃孵育箱培育5 d，經(jīng)Vitek 2 YST鑒定為白假絲酵母菌，然后再將此白假絲酵母菌制備成菌懸液，重復(fù)上述方法3次后，最后獲取的白假絲酵母菌為增強毒力菌株，將增強毒力菌株用0.1%吐溫80生理鹽水制備成濃度為1×107CFU/mL的菌懸液備用。將菌懸液用0.1%吐溫80生理鹽水稀釋10倍，取100 μL接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)2 d，計算白假絲酵母菌菌株的存活率[4-5]。

1.2.4 (1, 3)-β-D葡聚糖檢測方法 采用速率比濁法檢測(1, 3)-β-D葡聚糖：(1)取小鼠肺、肝組織勻漿500 mg，以400 g離心10 min；(2)取上清100 μL，加入樣品稀釋瓶中，在旋渦混合器上輕輕混勻，然后插入75 ℃試管恒溫儀中加熱10 min；(3)取0.25 mL試劑復(fù)溶液加入(1, 3)-β-D葡聚糖檢測試劑中；(4)取本試劑盒所配的專用反應(yīng)試管，先取已制備好的樣品供試溶液100 μL加入反應(yīng)試管中，然后再加入50 μL(1, 3)-β-D葡聚糖檢測試劑溶液，每個樣品供試溶液平行兩管；(5)加樣完畢，依次拿起試管在旋渦混合器上輕點一下，使試管中的溶液混合均勻，然后把各試管逐一插到LKM型動態(tài)試管檢測儀中，反應(yīng)開始，37℃反應(yīng)75 min，讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫抑制小鼠模型建立情況 免疫抑制組小鼠在用藥后第4天白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)均下降至最低值，低于其對照組，兩組白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；免疫抑制組小鼠在用藥后第4天平均體重為(18.00±2.05)g，同期其對照組平均體重為(25.00±2.06)g，兩組體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.557，P<0.01)。免疫抑制組小鼠均出現(xiàn)飲水和飲食明顯減少、喜靜、少動、消瘦、毛發(fā)稀疏等現(xiàn)象，用藥后第8天白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)及生活狀態(tài)逐漸恢復(fù)正常，觀察28 d無小鼠自然死亡現(xiàn)象。見表1。

表1 環(huán)磷酰胺對小鼠白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞影響的實驗室檢測結(jié)果(×109/L)

2.2 白假絲酵母菌感染模型建立情況

2.2.1 生存率 白假絲酵母菌感染組小鼠于注射白假絲酵母菌第2天后開始出現(xiàn)死亡，于第8天死亡率達(dá)70.00%(21/30)。白假絲酵母菌感染組生存率為30.00%，對照組生存率為100.00%，兩組生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.308，P<0.05)。見表2。

表2 白假絲酵母菌感染組與對照組小鼠注射真菌后不同時間死亡情況(只)

2.2.2 組織鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果 對注射真菌后第2～14天死亡小鼠以及第14天存活小鼠進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)肺、肝、腎組織出現(xiàn)多處膿腫，肉眼可見腎組織≥10處的膿腫壞死灶，其余組織膿腫及壞死灶均<10處，見圖1。取小鼠組織直接鏡檢發(fā)現(xiàn)腎、肺、肝、腸組織均可見大量菌絲和芽生孢子，見圖2。對小鼠組織進(jìn)行真菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)心、肺、肝、腎、腸、胸膜組織均有白假絲酵母菌生長，見圖3。

A：腎；B：肺；C：肝

A：腎；B：肺；C：肝；D腸

圖3 小鼠組織培養(yǎng)結(jié)果圖

2.2.3 組織病理學(xué)結(jié)果 白假絲酵母菌感染組小鼠經(jīng)PAS染色電鏡下(10×40)可見肺、肝、腎、腸組織中均可見大量菌絲和芽生孢子、組織壞死及炎性細(xì)胞浸潤。見圖4。

2.2.4 腎、肺組織(1, 3)-β-D-葡聚糖檢測結(jié)果 小鼠肺、腎組織行(1, 3)-β-D-葡聚糖檢測結(jié)果顯示，白假絲酵母菌感染組肺、腎組織(1, 3)-β-D-葡聚糖均增高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

A：腎；B：肺；C：肝；D腸

表3白假絲酵母菌感染組與對照組肺、 腎組織(1, 3)-β-D-葡聚糖檢測結(jié)果(pg/mL)

Table3Detection results of (1,3)-β-D-glucan in lung and kidney tissue ofC.albicansinfection group and control group (pg/mL)

組別肺組織腎組織感染組5 930.83±236.525 181.33±223.67對照組76.69±20.3475.62±18.34t70.35471.486P0.0000.000

3 討論

系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染是導(dǎo)致免疫力低下患者死亡的重要原因之一，其感染能力與菌株毒力、宿主免疫力密切相關(guān)[6]，BALB/c小鼠是常用實驗動物，是假絲酵母菌耐受鼠[7]，國內(nèi)外關(guān)于建立系統(tǒng)性假絲酵母菌感染動物模型方法的文獻(xiàn)報道很多，以往研究多經(jīng)尾靜脈途徑注射假絲酵母菌造成血流感染而建立系統(tǒng)性假絲酵母菌感染模型[8-9]；Diez-Orejas等[10]用健康雄性BALB/c小鼠以及Calera等[11]用健康雄性昆明小鼠，均經(jīng)尾靜脈途徑注射白假絲酵母菌建立系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的動物模型。本實驗先通過對雄性BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后(200 mg/kg·d，連續(xù)2 d)，于用藥后第4天小鼠血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均降至最低，觀察28 d小鼠無死亡現(xiàn)象，說明此方法能有效誘導(dǎo)小鼠免疫抑制。然后在免疫抑制小鼠用藥后第3天，經(jīng)腹腔注射白假絲酵母菌增強毒力株0.25 mL(濃度為1×107CFU/mL)，成功建立了免疫抑制BALB/c小鼠系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的動物模型，目前國內(nèi)尚未見通過此方法造模的相關(guān)報道。經(jīng)腹腔注射白假絲酵母菌造成小鼠腹腔器官浸潤和腸系膜淋巴吸收進(jìn)入血液而造成系統(tǒng)感染，這與腹部外科手術(shù)造成腸道假絲酵母菌種植腹腔而引起的系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染相類似[12-13]。因此，該方法既避免了經(jīng)小鼠尾靜脈注射操作的難度，又模擬了腹部外科手術(shù)導(dǎo)致系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的菌株體內(nèi)播散方式，有利于了解人類常見系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的途徑及發(fā)病機制。此方法操作簡單，成功率較高，適合系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染模型的建立。

系統(tǒng)性假絲酵母菌感染具有器官特異性[14]。本研究顯示，腹腔注射白假絲酵母菌建立的小鼠感染模型，各臟器感染以腎臟感染最為顯著。腹腔注射白假絲酵母菌首先引起腎組織嚴(yán)重?fù)p傷，肉眼可見腎組織多處膿腫，組織真菌直接鏡檢可見大量菌絲體，組織病理可見大量菌絲體、炎細(xì)胞及組織壞死；此外肝、肺、心、腸、胸膜等，也是白假絲酵母菌感染的重要靶器官，組織病理均可見菌絲、芽生孢子及炎性細(xì)胞浸潤。

(1, 3)-β-D-葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中，是真菌細(xì)胞壁重要組成部分，幾乎所有真菌細(xì)胞壁都含有(1, 3)-β-D-葡聚糖，其中以酵母樣菌含量最高，當(dāng)真菌侵入人體血液或組織，經(jīng)吞噬細(xì)胞吞噬消化后，(1, 3)-β-D-葡聚糖可以從胞壁中釋放出來，在血液、組織、體液中含量增加，因此，(1, 3)-β-D-葡聚糖已成為檢測真菌相關(guān)感染的一個有意義的生物指標(biāo)[15]。目前臨床上血清(1, 3)-β-D-葡聚糖的檢測方法主要用于診斷曲霉菌、假絲酵母菌感染[16-17]。此實驗研究顯示，白假絲酵母菌感染組肺、腎組織(1, 3)-β-D-葡聚糖均增高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明(1, 3)-β-D-葡聚糖的檢測方法，不但可診斷曲霉菌、假絲酵母菌感染，同樣也適用于系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的靶向臟器組織的檢測。故可以通過觀察藥物對臟器組織內(nèi)真菌細(xì)胞壁(1, 3)-β-D-葡聚糖影響的藥效及靶位臟器真菌感染的診斷。

總之，系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染動物模型的建立，需要考慮被感染動物的易感性或抗性。首先選擇合適的動物種類、免疫抑制動物模型的制備、感染菌株的致病性、菌懸液濃度、接種途徑等；實驗中依據(jù)真菌學(xué)(直接鏡檢、組織培養(yǎng))、病理學(xué)、(1, 3)-β-D-葡聚糖測定的方法，制定各項定性生物指標(biāo)，建立系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的生物指標(biāo)動物模型。本實驗通過對雄性BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后(200 mg/kg·d，連續(xù)2 d)，能有效誘導(dǎo)小鼠免疫抑制；然后在用藥后第3天，經(jīng)腹腔注射白假絲酵母菌增強毒力株0.25 mL(濃度為1×107CFU/mL)，可以成功建立免疫抑制BALB/c小鼠系統(tǒng)性白假絲酵母菌感染的動物模型。