郇 科，白 博，白曉智，蘇 菲，陳 瀟，桑宏勛,3

(1 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032； 2 陜西省第四人民醫(yī)院，陜西 西安 710043； 3 南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518101)

目前，燙傷已成為日常生產(chǎn)及生活中最常見的意外損傷之一。據(jù)統(tǒng)計，我國每年每百萬人口中約有5 000～10 000人遭受燙傷[1-2]。創(chuàng)面感染是燙傷后最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，引起創(chuàng)面感染的細(xì)菌主要為革蘭陰性桿菌，其中銅綠假單胞菌是最常見的致病菌之一[3]。燙傷后創(chuàng)面感染如得不到及時救治，可能會引起嚴(yán)重后果，給患者帶來沉重的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，患者的病死率明顯升高[4-5]。動物燙傷感染模型的成功構(gòu)建在創(chuàng)面修復(fù)方面的研究以及表面藥物或敷料方面的研發(fā)中發(fā)揮著重要作用，因此，建立一種簡單易行、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的燙傷感染模型具有重要意義[6-7]。本實驗應(yīng)用自制燙傷儀對大鼠進行蒸汽燙傷，構(gòu)建大鼠燙傷模型，排除重力、壓力等因素的影響，在燙傷溫度一致的情況下，燙傷時間成為控制燙傷深度的唯一因素。創(chuàng)面感染的病原菌選擇臨床上最常見的銅綠假單胞菌，其毒力穩(wěn)定，易于培養(yǎng)分離，是制作創(chuàng)面感染的理想細(xì)菌。目前，對創(chuàng)面感染所需接種細(xì)菌濃度及接種方法方面的實驗研究較少，本實驗選擇將3種不同濃度的細(xì)菌接種于燙傷創(chuàng)面，比較不同濃度的細(xì)菌感染大鼠深Ⅱ度創(chuàng)面愈合過程中不同時間痂面下細(xì)菌含量、愈合時間長短，從而選擇出細(xì)菌感染最佳濃度，同時比較兩種細(xì)菌接種方法的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 雄性清潔級SD大鼠90只，體重186～253 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供；銅綠假單胞菌ATCC 27853由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科提供；戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司，異氟烷購自河北九派制藥有限公司，SP-CT/218T型蒸汽掛燙機購自上海旭博公司，旋轉(zhuǎn)切片機購自德國LEICA公司，CX31顯微鏡及攝像系統(tǒng)購自日本Olympus公司。

1.2 燙傷模型制備及最佳致傷時間分析

1.2.1 燙傷模型制備 拔掉SP-CT/218T型蒸汽掛燙機噴頭，將容積50 mL、開口直徑3 cm的耐熱塑料管與導(dǎo)氣管對接并固定組成噴頭，在厚度2.5 cm耐熱塑料板上做一個直徑3.0 cm的圓形模具開口。選取40只SD大鼠，隨機分成5組，每組8只。實驗前1天給予10 g/L戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，麻醉后采用動物專用電剃刀剃去大鼠背部長毛，并給予80 g/L硫化鈉進行脫毛。大鼠脫毛2 h后將掛燙機預(yù)熱1 min，待蒸汽溫度94 ℃，助手將直徑3 cm模具置于大鼠背部待燙部位并固定，掛燙機噴頭垂直置于模具上方進行燙傷并計時，各組大鼠致傷時間點分別為4、6、8、10、12 s，每只大鼠脊柱兩側(cè)分別致傷2個相同創(chuàng)面，致傷后創(chuàng)面未予任何處理，且立即給予大鼠腹腔注射5 mL生理鹽水抗休克，然后將大鼠回籠后分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 最佳致傷時間分析 致傷24 h后觀察大鼠一般情況，每組選取6只燙傷大鼠處死，取1.5 cm ×0.5 cm大鼠創(chuàng)面全層皮膚樣本，采用甲醛固定24 h后進行切片，切片組織進行HE染色，根據(jù)相關(guān)文獻[8]判定燙傷深度。大鼠燙傷12 h后，燙傷時間4 s時大鼠創(chuàng)面皮膚表皮淺層受損，可見基底細(xì)胞層；燙傷時間6 s時大鼠創(chuàng)面皮膚表皮淺層壞死，部分真皮受損；燙傷時間8 s時大鼠皮膚表皮深層及真皮深層受損；燙傷時間10 s和12 s時大鼠創(chuàng)面皮膚全層及皮下組織皮膚附件完全受損。大鼠燙傷12 h后創(chuàng)面損傷逐漸發(fā)展，各組大鼠燙傷后不同時間點創(chuàng)面病理結(jié)果存在差異。大鼠燙傷24 h后，燙傷時間4 s大鼠創(chuàng)面皮膚表皮淺層受損，符合Ⅰ度燙傷標(biāo)準(zhǔn)；燙傷時間6 s大鼠創(chuàng)面表皮壞死脫落，部分細(xì)胞充血水腫，白細(xì)胞浸潤，膠原纖維離散腫脹，符合淺Ⅱ度燙傷標(biāo)準(zhǔn)；燙傷時間8 s大鼠創(chuàng)面皮膚表皮細(xì)胞核固縮，真皮深層受損，膠原纖維融合，毛囊殘留，符合深Ⅱ度燙傷標(biāo)準(zhǔn)；燙傷時間10 s和12 s大鼠創(chuàng)面皮膚全層及皮下組織皮膚附件完全受損，傷及肌肉層，符合Ⅲ度燙傷標(biāo)準(zhǔn)。見圖1。燙傷時間8 s為深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面最佳致傷時間，組織取材最佳時間為燙傷后24 h。

a：燙傷時間4 s，表皮淺層壞死；b：燙傷時間6 s，表皮深層受損；c：燙傷時間8 s，真皮淺層受損；d：燙傷時間10 s，真皮深層壞死

1.3 細(xì)菌菌懸液制備和創(chuàng)面感染模型構(gòu)建

1.3.1 細(xì)菌菌懸液制備 將銅綠假單胞菌ATCC 27853復(fù)蘇后接種于瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～20 h，用接種環(huán)挑取菌落接種于血培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h，采用稀釋法配制濃度為1×107、1×108和1×109CFU/mL的新鮮菌懸液。

1.3.2 創(chuàng)面感染模型構(gòu)建 隨機選取30只大鼠，按隨機數(shù)字表法分為3組，每組10只，采用最佳致傷時間8 s構(gòu)建深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型。燙傷30 min待皮膚冷卻后，燙傷大鼠創(chuàng)面切痂，3組大鼠一側(cè)創(chuàng)面分別接種濃度為1×107、1×108和1×109CFU/mL的銅綠假單胞菌菌懸液0.3 mL，另一側(cè)接種等體積生理鹽水作為對照組，以無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，紗布邊緣與正常皮膚縫合固定。

1.4 創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、細(xì)菌定量及創(chuàng)面愈合時間 創(chuàng)面痂下接種細(xì)菌24 h后，觀察創(chuàng)面狀況，并取創(chuàng)面組織進行HE染色，采用顯微鏡觀察創(chuàng)面炎癥反應(yīng)情況。每組10只大鼠分別于接種細(xì)菌后1 、2、4、7和14 d取創(chuàng)面中心少許組織，放入勻漿器中，加入2 mL生理鹽水，電動攪拌器充分勻漿，然后將勻漿液按照1∶10比例稀釋，然后取0.1 mL稀釋液接種于瓊脂平板，在37 ℃條件下孵育18～24 h后進行細(xì)菌計數(shù)。含菌量(CFU/g)=菌落數(shù)(CFU)×稀釋倍數(shù)/組織重量(g)。創(chuàng)面愈合標(biāo)準(zhǔn)定義為創(chuàng)面完全上皮化，分別記錄各組大鼠創(chuàng)面愈合時間。

1.5 創(chuàng)面細(xì)菌接種方法比較 選取20只大鼠按隨機數(shù)字表法分為2組，每組10只，按照最佳致傷時間8 s制成深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型，配制濃度1×109CFU/mL新鮮銅綠假單胞菌菌液。第1組(切痂涂抹法)大鼠創(chuàng)面切痂后立即接種1×109CFU/mL銅綠假單胞菌菌液0.3 mL，然后以無菌紗布覆蓋創(chuàng)面并與邊緣正常皮膚縫合固定；第2組(痂下埋藏法)大鼠創(chuàng)面不切痂，用小剪刀在創(chuàng)面痂邊緣剪開一小口，然后將含1×109CFU/mL 0.3 mL銅綠假單胞菌菌液的小紗條塞入痂面下,以無菌紗布覆蓋后與邊緣正常皮膚縫合固定。參照1.4的方法和步驟計算含菌量、創(chuàng)面愈合時間。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面一般情況 燙傷開始至傷后24 h各組大鼠創(chuàng)面均呈圓形，直徑約3.0 cm，燙傷8 s時創(chuàng)面與正常組織分界清楚，創(chuàng)面高出正常皮膚，隨著致傷時間延長，創(chuàng)面潮濕、質(zhì)感較硬、色澤漸暗、創(chuàng)面顏色由白色變?yōu)榛野?。致傷時間8 s，大鼠傷后24 h創(chuàng)面質(zhì)硬、無滲出、呈灰褐色，見圖2。

圖2 致傷時間8 s大鼠傷后24 h創(chuàng)面一般情況

Figure2General condition of wound 24 hours after 8-second injury in rats

2.2 不同濃度細(xì)菌感染創(chuàng)面時大鼠全身狀況及創(chuàng)面組織學(xué)觀察 3組大鼠一般精神狀態(tài)可，進食好，眼部無分泌物。第1組感染菌量為1×107CFU/mL的大鼠創(chuàng)面分泌物較少有些甚至無分泌物，銅綠假單胞菌特有的惡臭味不明顯，顯微鏡下可見少許炎性細(xì)胞浸潤。第2組感染菌量為1×108CFU/mL的大鼠創(chuàng)面可見分泌物較多，并可聞及明顯的惡臭味，顯微鏡下可見創(chuàng)面表皮及真皮淺層炎性細(xì)胞浸潤明顯。第3組感染菌量為1×109CFU/mL的大鼠創(chuàng)面可見大量分泌物，惡臭味明顯，顯微鏡下可見彌漫性皮膚全層及肌層炎性細(xì)胞浸潤，見圖3、4。

2.3 創(chuàng)面痂下細(xì)菌定量結(jié)果 接種1×107CFU/mL細(xì)菌的大鼠創(chuàng)面細(xì)菌含量低于1×105CFU/g，第5天后細(xì)菌含量逐漸下降。接種1×108CFU/mL細(xì)菌的大鼠創(chuàng)面細(xì)菌含量高于1×105CFU/g，第7天后細(xì)菌含量逐漸下降。接種1×109CFU/mL細(xì)菌大鼠創(chuàng)面細(xì)菌含量高于1×105CFU/g，接種細(xì)菌后14 d 內(nèi)細(xì)菌含量高于1×105CFU/g，并呈明顯持續(xù)上升趨勢。見表1。

a：接種菌量為1×107CFU/mL的大鼠創(chuàng)面未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；b:接種菌量為1×108CFU/mL的大鼠創(chuàng)面可見表皮及真皮淺層炎性細(xì)胞浸潤；c:接種菌量為1×109CFU/mL的大鼠創(chuàng)面可見皮膚全層及肌層彌漫性炎性細(xì)胞浸潤

圖3深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面接種不同濃度銅綠假單胞菌后組織學(xué)表現(xiàn)(HE×200)

Figure3Histological observation of wound of rats with deep second-degree scald after inoculated with different concentrations ofP.aeruginosa(HE×200)

a:接種1×107CFU/mL細(xì)菌的大鼠創(chuàng)面基本紅潤，有少量分泌物；b:接種1×108CFU/mL細(xì)菌的大鼠創(chuàng)面可見的膿性分泌物；c:接種1×109CFU/mL細(xì)菌的大鼠創(chuàng)面可見大量膿性分泌物

圖4深Ⅱ度燙傷大鼠創(chuàng)面接種不同濃度銅綠假單胞菌后外觀表現(xiàn)

Figure4Appearance of wound of rats with deep second-degree scald after inoculated with different concentrations ofP.aeruginosa

表13組大鼠創(chuàng)面接種不同濃度銅綠假單胞菌后各時間點痂下細(xì)菌含量(×105CFU/g)

Table1Subeschar bacterial count of 3 groups of rats at different time points after inoculated different concentrations ofP.aeruginosa(×105CFU/g)

組別1 d2 d4 d7 d14 d接種1×109 CFU/mL細(xì)菌組(n=10)2.60±0.994.60±0.427.10±0.5627.02±1.8738.10±3.39接種1×108 CFU/mL細(xì)菌組(n=10)1.20±0.552.40±0.643.74±1.125.14±1.402.71±0.79接種1×107 CFU/mL細(xì)菌組(n=10)0.35±0.111.20±0.461.70±0.710.71±0.320.56±0.11

2.4 創(chuàng)面愈合時間比較 接種1×109CFU/mL銅綠假單胞菌的大鼠創(chuàng)面愈合時間為(21.4±2.4)d，長于對照組的創(chuàng)面愈合時間(18.4±1.7)d(t=2.72，P<0.05)。接種1×108CFU/mL銅綠假單胞菌的大鼠創(chuàng)面愈合時間為(19.4±1.1)d，接種1×107CFU/mL銅綠假單胞菌的大鼠創(chuàng)面愈合時間為(18.3±1.3)d，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為1.33、0.16，均P>0.05)。

2.5 兩種接種方法比較 兩種方法分別接種1×109CFU/mL細(xì)菌后14 d，大鼠創(chuàng)面痂下細(xì)菌含量均高于1×105CFU/g，呈持續(xù)上升趨勢。見表2。痂下埋藏法愈合時間(22.5±1.5)d，切痂涂抹法愈合時間為(21.8±1.3)d，兩種接種方法愈合時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1，P>0.05)。

表2兩種方法接種1×109CFU/mL銅綠假單胞菌后各時間點大鼠創(chuàng)面痂下細(xì)菌含量(×105CFU/g)

Table2Subeschar bacterial count of rats at different time points after inoculated 1×109CFU/mLP.aeruginosaby two methods(×105CFU/g)

組別1 d2 d4 d7 d14 d痂下埋藏法(n=10)2.89±0.144.72±0.527.97±0.4528.27±0.8738.61±1.80切痂涂抹法(n=10)2.32±0.044.27±0.596.73±0.6726.73±0.6836.73±1.38

3 討論

為客觀的評價療效，動物燙傷合并創(chuàng)面感染模型的構(gòu)建在燙傷藥物及敷料的研究中扮演著舉足輕重的角色，因此，建立一種簡便規(guī)范、可控制、重復(fù)性強，且與臨床接近的動物模型，對燙傷合并創(chuàng)面感染的治療和藥物研究具有重要意義。

目前，國內(nèi)外關(guān)于燙傷合并感染創(chuàng)面模型的研究較多[9-10]，其中Ⅰ度和淺Ⅱ度燙傷的創(chuàng)傷程度較輕，僅傷及表皮和真皮層，創(chuàng)面感染可以被自身清除，以自然愈合為主，創(chuàng)面的愈合過程和愈合時間接近；Ⅲ度燙傷由于創(chuàng)傷嚴(yán)重，容易造成侵襲性傷害，治療周期長，病死率高，不適合進行動物模型相關(guān)研究[11]。深Ⅱ度燙傷創(chuàng)傷程度適中，創(chuàng)傷達(dá)真皮乳頭層，損傷部分為網(wǎng)狀層及皮膚附件結(jié)構(gòu)，愈合周期在3周左右，能比較出各種治療措施的療效，是比較理想的燙傷動物模型[12]。

近年來，制作動物燒燙傷模型常用方法包括溴鎢燈光輻射及閃光粉致動物體表燒傷、凝固汽油燃燒或開水燙傷致動物體表燒傷法、磷燒傷及高溫金屬模具燒傷等[13-14]。燙傷對皮膚的損害程度主要與致傷溫度、時間、面積等因素相關(guān)，但以上方法不同程度上存在模型燙傷創(chuàng)面深度不一致、創(chuàng)面面積難以控制、致傷溫度不恒定、操作過程繁瑣等缺點，導(dǎo)致可重復(fù)性和實驗效果均較差[15]。通過綜合各種方法的優(yōu)點，本研究應(yīng)用的恒溫蒸汽燙傷儀可在溫度、時間和面積等方面達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，提高動物模型構(gòu)建的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。與傳統(tǒng)模型相比，本研究建立的動物燙傷模型皮膚損傷僅由熱力所致，排除了重力等因素的影響，在燙傷溫度一致的情況下，燙傷時間成為控制燙傷深度的關(guān)鍵因素[16]。恒溫蒸汽燙傷儀具有燙傷面積可控、深度均勻、創(chuàng)面干凈、操作簡單等優(yōu)點，適合進行各種創(chuàng)面藥物及敷料的比較及作用機制研究。

本實驗組織病理觀察可見燙傷深度隨著致傷時間的延長逐漸加深。燙傷12 h時損傷處于進展階段；燙傷24 h時創(chuàng)面深度穩(wěn)定，同一致傷時間的病理結(jié)果一致；燙傷48 h時創(chuàng)面病理結(jié)果與傷后 24 h 比較無明顯差異。燙傷對皮膚組織的損傷是動態(tài)變化的過程，因此，判定燙傷深度應(yīng)以傷后 24 h后的結(jié)果為準(zhǔn)，其中組織學(xué)病理觀察被認(rèn)為是確定燙傷深度的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。燙傷合并創(chuàng)面感染后，機體免疫細(xì)胞啟動炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞并聚集[18]。

細(xì)菌負(fù)荷是影響創(chuàng)面感染的一個重要因素，當(dāng)細(xì)菌負(fù)荷大于宿主的免疫防御能力時出現(xiàn)感染癥狀[19]。Krizek等[20]研究證實，當(dāng)感染細(xì)菌負(fù)荷水平<105CFU/g，傷口愈合時間才開始逐漸延長。本實驗結(jié)果顯示，細(xì)菌負(fù)荷高于1×105CFU/g，愈合時間明顯延長，被認(rèn)為是有效感染的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。本組實驗結(jié)果顯示，燙傷后創(chuàng)面接種細(xì)菌濃度不同創(chuàng)面感染程度不同，動物全身炎癥反應(yīng)也不同。當(dāng)接種細(xì)菌濃度為1×108CFU/mL和1×107CFU/mL時，接種后4 d和7 d 細(xì)菌負(fù)荷開始減少，細(xì)菌大部分可以被機體清除，炎癥反應(yīng)不明顯；與生理鹽水對照組相比，炎性細(xì)胞浸潤程度無明顯差別，且合并感染的創(chuàng)面愈合時間和生理鹽水對照組相近。當(dāng)接種細(xì)菌濃度為1×109CFU/mL時，接種細(xì)菌后14 d內(nèi)，痂下細(xì)菌含量呈持續(xù)上升趨勢，且創(chuàng)面炎癥反應(yīng)明顯，炎性細(xì)胞廣泛浸潤；與對照組相比，創(chuàng)面愈合時間延長。由此可以確定，接種細(xì)菌濃度1×109CFU/mL符合燙傷合并創(chuàng)面感染的發(fā)展進程，可以用來比較藥物及敷料的療效。

比較切痂涂抹法和痂下埋藏法兩種接種方法，結(jié)果顯示，兩種方法形成的創(chuàng)面愈合時間相近，痂下埋藏法與自然的創(chuàng)面感染不同，局部易形成膿腫，感染灶不均勻，切痂涂抹法更接近臨床感染，更適合進行燙傷合并感染的研究。

綜上所述，本組研究結(jié)果提示，溫度94℃、燙傷時間8 s、接種1×109CFU/mL濃度的銅綠假單胞菌為制作SD大鼠深Ⅱ度燙傷合并銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的最佳條件。由此條件構(gòu)建的模型燙傷深度一致、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好，大鼠創(chuàng)面感染率高、病死率低，為燙傷患者創(chuàng)面治療及修復(fù)機制的研究提供了實驗室依據(jù)。但是，本研究仍存在一些不足，燙傷部位選取大鼠脊柱兩側(cè)皮膚，大鼠背部身體弧度使模具與皮膚接觸不均勻，導(dǎo)致創(chuàng)面中間深、周圍淺，應(yīng)進一步對模具及其固定方法進行改善；大鼠背部創(chuàng)面的敷料采用膠布固定時，動物搔抓容易脫落，用環(huán)形膠布固定時包扎過緊使動物腹壓增加，影響動物進食。采用創(chuàng)緣與紗布縫合固定，防止動物搔抓紗布敷料引起脫落，但縫合可以加重局部損傷，再加上大鼠個體差異及對感染的耐受程度不同等因素，均可以影響愈合過程及愈合時間。