趙璐璐, 趙 澤, 楊 鑫, 劉興健, 胡小元, 張志芳, 李軼女*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018

干擾素是一類具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子，在不同途徑上影響細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和分化。它是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，也是研究得最清楚的細(xì)胞因子之一[1]。1957年，英國(guó)病毒學(xué)家Alick Isaacs和瑞士研究者Jean Lindenmann在研究病毒干擾時(shí)發(fā)現(xiàn)存在對(duì)活病毒的繁殖起干擾作用的物質(zhì)，將其命名為“干擾素”，并獲得國(guó)際公認(rèn)[2]。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的基礎(chǔ)和臨床研究，干擾素已經(jīng)成為一種重要的廣譜抗病毒、抗腫瘤治療藥物[3]。

干擾素存在多個(gè)類型，綜合受體結(jié)構(gòu)特征、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生物學(xué)功能，將其分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型干擾素表達(dá)譜廣，IFNARl和IFNAR2是Ⅰ型干擾素的兩個(gè)受體亞基。Ⅰ型干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒活性，Muller等[4]在受體基因敲除的小鼠中，證實(shí)了Ⅰ型干擾素在抗病毒中的重要作用。Ⅱ型干擾素(IFN-γ)的受體亞基由IFNγRI和IFNγR2組成[5]。Ⅱ型干擾素基因敲除和其受體基因敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)均表明抗病毒活性不是IFN-γ的主要生物學(xué)活性[6～8]。IFN-γ在抗腫瘤免疫應(yīng)答中有重要作用，它是一種免疫干擾素，可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞殺死微生物，亦可與Ⅰ型干擾素聯(lián)用，增強(qiáng)Ⅰ型干擾素的抗病毒活性，在自然免疫以及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用[5,9,10]。

Ⅲ型干擾素是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)[11]。IFN-λR1和IL-10R2是Ⅲ型干擾素的受體分子，其中IFN-λR1是Ⅲ型干擾素的特異性受體分子，決定了IFN-λs發(fā)揮作用的細(xì)胞組織譜[5]。2011年美國(guó)梅島動(dòng)物疾病中心首次克隆出牛的Ⅲ型干擾素IFN-λ3，它與人、小鼠、豬的IFN-λ3序列具有顯著相似性。牛的IFN-λ3基因由588個(gè)堿基組成，編碼195個(gè)氨基酸，其中包含N端23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列[12]。

本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中構(gòu)建了一種失活拯救型家蠶桿狀病毒穿梭載體reBmBac，載體上的誘導(dǎo)型大腸桿菌復(fù)制子使其可以在大腸桿菌中復(fù)制并在誘導(dǎo)條件下形成多拷貝，病毒復(fù)制必需基因的敲除使其在重組病毒構(gòu)建時(shí)獲得重組病毒的效率幾乎可以達(dá)到100%[13]。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用該表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了多種真核來(lái)源蛋白的表達(dá)，并獲得了多種具有天然活性或結(jié)構(gòu)的表達(dá)產(chǎn)物。本研究利用該表達(dá)系統(tǒng)快速構(gòu)建了牛IFN-λ3基因的重組病毒并在家蠶中進(jìn)行表達(dá)以獲得目的表達(dá)產(chǎn)物，以期為牛λ3干擾素產(chǎn)品的生產(chǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

失活拯救型穿梭質(zhì)粒[13]、家蠶卵巢傳代細(xì)胞系(Bm-N)、牛腎細(xì)胞(MDBK)和大腸桿菌TOP10菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存；重組水皰型口炎病毒(VSV*GFP)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所贈(zèng)予；實(shí)驗(yàn)用家蠶品種為JY1，由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所提供；桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393、脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司；2k Plus Ⅱ DNA Marker、高保真DNA聚合酶Fast pfu購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司；昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100購(gòu)自德國(guó)AppliChem公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1牛IFN-λ3基因的優(yōu)化及合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取已公布的BoIFN-λ3氨基酸序列，選用MEGA軟件對(duì)獲取的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)出一條共有序列，綜合考慮家蠶密碼子偏好性、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量等因素，確定最優(yōu)核苷酸序列，并在BoIFN-λ3基因起始密碼子前引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和Kozak序列，在其終止密碼子后引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，隨后將待合成序列交由南京金斯瑞公司合成。

1.2.2轉(zhuǎn)移載體pVL1393-BoIFN-λ3的構(gòu)建 合成的牛IFN-λ3基因連接在pUC57載體上，鑒定后，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pUC57-BoIFN-λ3，回收得到BoIFN-λ3基因片段，并將其連接在被BamHⅠ和EcoRⅠ酶切的pVL1393載體上，隨后將構(gòu)建的載體pVL1393-BoIFN-λ3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落提取質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定后，得到克隆有BoIFN-λ3基因的轉(zhuǎn)移載體pVL1393-BoIFN-λ3。

1.2.3重組桿狀病毒的構(gòu)建及BoIFN-λ3在家蠶中的表達(dá) 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染[14]，在BmN細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)桿狀病毒基因組DNA(reBmBac)和轉(zhuǎn)移載體pVL1393-BoIFN-λ3的重組。將reBmBac和pVL1393-BoIFN-λ3混合后，共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，27℃培養(yǎng)4～5 d，細(xì)胞懸浮后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，并將其離心取上清，PCR鑒定正確后得到重組桿狀病毒reBm-BoIFN-λ3。重組病毒液按105pfu/頭的劑量，注射五齡起蠶(或蠶蛹)，同時(shí)設(shè)健康家蠶為空白對(duì)照組，約4～5 d，待家蠶發(fā)病后，收集蠶血淋巴(或蠶蛹)，-20℃保存，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4堿裂解法提取蠶血淋巴基因組DNA 取50 μL蠶血樣品，加入等體積的1 mol/L NaOH，輕輕混勻后，室溫放置5 min；加入10 μL 10 mol/L NH4AC后輕輕混勻，室溫作用5 min，以中和上步過(guò)程中的堿液；然后，用飽和酚氯仿/異戊醇來(lái)去除蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)12 000 r/min離心10 min后，取上清；用2.5倍體積的乙醇來(lái)沉淀核酸，沉淀經(jīng)過(guò)75%的冷酒精離心洗滌，然后將體系中殘余酒精揮發(fā)掉；最后將沉淀溶解在20 μL的TE中，即得所需基因組DNA。

1.2.5BoIFN-λ3抗病毒活性檢測(cè) 采用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定干擾素表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性[15,16]，在MDBK細(xì)胞系中檢測(cè)干擾素表達(dá)產(chǎn)物對(duì)VSV*GFP的抑制作用，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得到干擾素抗病毒活性。將蠶血淋巴樣品稀釋1 000倍后，以3倍稀釋度做梯度稀釋，共設(shè)置7個(gè)稀釋度，且每個(gè)稀釋度有8個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞孔分別加入100 μL處理后的樣品，攻毒100 TCID50，隨后，將其在37℃、5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)分別設(shè)置只加病毒不加干擾素的細(xì)胞孔作為病毒對(duì)照組,及不加病毒和干擾素的健康細(xì)胞作為空白對(duì)照組。攻毒24 h后，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞病變情況，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)量來(lái)評(píng)估細(xì)胞的病變水平，進(jìn)而反映出干擾素的抗病毒活性。

1.2.6重組病毒的篩選 由于共轉(zhuǎn)染獲得的是大量重組桿狀病毒的混合物，每一個(gè)重組桿狀病毒粒子個(gè)體之間存在一些差異。根據(jù)已有研究經(jīng)驗(yàn)，不同重組桿狀病毒之間表達(dá)干擾素的水平差異較大，需要通過(guò)篩斑實(shí)驗(yàn)得到多個(gè)重組病毒的單拷貝毒株，通過(guò)對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)量的檢測(cè)，篩選出干擾素表達(dá)水平相對(duì)較高的毒株用于后續(xù)研究以及規(guī)?；a(chǎn)[13]。篩選的操作如下：在35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種BmN細(xì)胞；用TC-100無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋共轉(zhuǎn)染上清液(含有重組病毒)，稀釋10 000倍后，取1 mL病毒稀釋液感染BmN細(xì)胞；27℃培養(yǎng)1 h后，棄掉上清，加入含10%血清和1% 低熔點(diǎn)凝膠的TC-100培養(yǎng)基，隨后在27 ℃培養(yǎng)箱中，孵育培養(yǎng)4～5 d；在解剖鏡下觀察半固體培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)皿中的空斑并進(jìn)行挑選、編號(hào)，將挑選的病毒粒子接種到培養(yǎng)有BmN細(xì)胞的24孔板中，27℃培養(yǎng)后，收取24孔板中各上清，獲得24個(gè)篩選的病毒毒株。將24個(gè)病毒毒株感染家蠶幼蟲(chóng)，待家蠶發(fā)病后收集蠶血淋巴檢測(cè)其抗病毒活性，篩選出高效表達(dá)牛λ3干擾素的毒株。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)移載體pVL1393-BoIFN-λ3的酶切鑒定

pVL1393-BoIFN-λ3質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離出2個(gè)片段(圖1)，小片段位于500～750 bp之間，與目的基因片段588 bp大小相符，大片段位于8 000 bp上方，與pVL1393片段9 607 bp大小相符。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid.M：DNA marker;1：pVL1393-BoIFN-λ3重組質(zhì)粒;2: 陰性對(duì)照：pVL1393載體

2.2 重組桿狀病毒在家蠶中的鑒定

將重組桿狀病毒液注射五齡起蠶，4 d左右蠶發(fā)病，收集發(fā)病蠶蠶血。為了確定目的重組病毒已感染家蠶，我們根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)提取的病蠶血淋巴基因組，通過(guò)PCR的方法鑒定目的基因是否重組到病毒基因組中。BoIFN-λ3基因大小為588 bp，如圖2所示，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致，表明目的片段BoIFN-λ3已重組到病毒基因組中，并在家蠶中擴(kuò)增。

2.3 BoIFN-λ3抗病毒活性檢測(cè)

應(yīng)用微量細(xì)胞病變抑制法在MDBK/VSV*GFP系統(tǒng)上檢測(cè)家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的BoIFN-λ3抗病毒活性[16]。在熒光顯微鏡下觀察到，加入高濃度干擾素的細(xì)胞孔中的病毒復(fù)制過(guò)程被完全抑制，無(wú)綠色熒光出現(xiàn)(圖3A,彩圖見(jiàn)圖版六)；病毒對(duì)照組中的細(xì)胞發(fā)生病變，大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光(圖3B)；加入低濃度BoIFN-λ3蛋白的細(xì)胞抵抗病毒感染的能力有限(圖3C)，部分細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光；空白對(duì)照組中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)綠色熒光出現(xiàn)(圖3D)。根據(jù)BoIFN-λ3對(duì)MDBK細(xì)胞的保護(hù)作用，觀察細(xì)胞的病變程度，待有綠色熒光細(xì)胞出現(xiàn)，這一孔細(xì)胞就記為“+”，未出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞記作“-”，檢測(cè)結(jié)果列于表1，按照Reed-Muench方法計(jì)算干擾素的效價(jià)，蠶體中表達(dá)BoIFN-λ3的效價(jià)可達(dá)(2.7±0.12)×105U/mL。

圖2 重組桿狀病毒感染家蠶中目的基因PCR鑒定Fig.2 PCR identification of target gene in silkworm infected by recombinant baculovirus.M：DNA marker;1:陰性對(duì)照;2：目的基因BoIFN-λ3

2.4 重組病毒的篩選

空斑篩選24個(gè)重組病毒，將其分別感染家蠶，并對(duì)其血淋巴樣品進(jìn)行抗病毒活性的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如圖4所示，0號(hào)為共轉(zhuǎn)染液感染家蠶后，蠶血淋巴樣品的抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果，約為(2.7±0.12)×105U/mL，1～24為篩選的24個(gè)樣品，4號(hào)樣品的抗VSV病毒活性最高，可達(dá)到(8.1±0.52)×105U/mL。因此可選用4號(hào)重組病毒的毒株應(yīng)用于后續(xù)牛λ3干擾素的生產(chǎn)工作。

圖3 牛腎細(xì)胞(MDBK)感染VSV病毒發(fā)病的情況Fig.3 The morbidity of MDBK cells infected with VSV.A: 干擾素抑制 VSV 病毒復(fù)制 ;B: VSV病毒對(duì)照組;C: 在低濃度干擾素存在情況下部分細(xì)胞有 VSV 病毒感染;D: 空白對(duì)照。(彩圖見(jiàn)圖版六)

干擾素蠶血淋巴梯度稀釋倍數(shù)3.0×1039×1032.7×1048.1×1042.4×1057.2×1052.2×106陰性對(duì)照a空白對(duì)照bBoIFN-λ3----++++--+-+++++--++++-++---+--+++--++++-++-----++-+----+-+++---++-+++-

注：“-”表示無(wú)綠色熒光； “+”表示超過(guò)50%的細(xì)胞顯示綠色熒光；a：陰性對(duì)照組：培養(yǎng)基+MDBK細(xì)胞+VSV-GFP病毒；b：空白對(duì)照組：培養(yǎng)基+MDBK細(xì)胞。

圖4 不同重組病毒表達(dá)BoIFN-λ3的活性測(cè)定Fig.4 Antiviral activity assay of BoIFN-λ3 expressed by recombinant baculovirus.0:共轉(zhuǎn)染液感染家蠶后，蠶血淋巴樣品的抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果; 1～24:為篩選的24個(gè)樣品。

3 討論

本研究利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了牛λ3干擾素的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中結(jié)合多種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)家蠶桿狀病毒BmNPV基因組進(jìn)行了改造，構(gòu)建了一套有特色的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)[13]。其中，病毒復(fù)制必需基因ORF1629的刪除使得共轉(zhuǎn)染過(guò)程中只有插入外源基因的重組病毒才能在家蠶細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，使得共轉(zhuǎn)染獲得的重組病毒純度幾乎達(dá)到100%，重組率得到顯著提高。

在系統(tǒng)發(fā)生上，Ⅲ型干擾素IFN-λs與Ⅰ型干擾素、IL-10關(guān)系密切，在氨基酸序列上存在5%～18%的相似性。IFN-λs和Ⅰ型干擾素在抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能上有很大的相似之處。不同的是，IFN-λs的表達(dá)范圍較小，只在有限的器官、組織和細(xì)胞中表達(dá)[17]，主要分布在消化道、呼吸道、皮膚組織和肝臟、腎臟等器官中，特別是在上皮細(xì)胞中高表達(dá)，這就導(dǎo)致對(duì)Ⅲ型干擾素的應(yīng)答主要發(fā)生在上皮樣組織中[18]。IFN-λs可誘導(dǎo)宿主表達(dá)干擾素刺激基因ISGl5、蛋白激酶PKR、寡腺苷酸合成酶基因家族蛋白OAS、 粘病毒抗性蛋白Mx1等因子，起到抗病毒保護(hù)作用[19]；在抗肺癌研究中，與IFN-γ相比IFN-λs能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡，單獨(dú)使用或與IFN-γ聯(lián)合使用均具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[20]。此外，有研究證明IFN-λs所介導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路中STATI和STAT2的活化狀態(tài)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，從而發(fā)揮比IFN-a更持久的效應(yīng)作用，這可能提示IFN-λs作為一種長(zhǎng)效藥物在治療腫瘤時(shí)有更廣闊的應(yīng)用[21]。

牛病毒性傳染病如口蹄疫(FMD)、牛病毒性腹瀉病(BVD)和牛傳染性鼻氣管炎(IBR)等可通過(guò)消化道、呼吸道傳播，至今仍形勢(shì)比較嚴(yán)峻，因此牛IFN-λ3成為繼IFN-α和IFN-β后，抗病毒制劑研發(fā)的一個(gè)方向。Fayna等[22,23]利用腺病毒Ad5表達(dá)BoIFN-λ3具有較強(qiáng)的抗病毒活性，在抗口蹄疫病毒FMDV的研究中，檢測(cè)到干擾素刺激基因ISG在呼吸道、皮膚組織的表達(dá)，在一定程度上延緩了機(jī)體感染FMDV病毒的時(shí)間、減輕了感染FMDV的臨床癥狀。張瑞祥等[12]在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了BoIFN-λ3的可溶性表達(dá)，生物學(xué)效價(jià)可達(dá)(2.39±0.15)×106U/mL。本研究利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組BoIFN-λ3，抗病毒活性可達(dá)(2.7±0.12)×105U/mL左右。由于共轉(zhuǎn)染獲得的是大量重組桿狀病毒的混合物，每一個(gè)重組桿狀病毒粒子個(gè)體之間存在一些差異。根據(jù)以往研究經(jīng)驗(yàn)，不同重組桿狀病毒之間表達(dá)干擾素的水平差異較大，需要通過(guò)篩斑實(shí)驗(yàn)得到多個(gè)重組病毒的單拷貝毒株，通過(guò)對(duì)其產(chǎn)物表達(dá)量的檢測(cè)，獲得表達(dá)水平較高的毒株用于后續(xù)研究以及大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用[13]，實(shí)現(xiàn)了BoIFN-λ3蛋白的高效表達(dá)。在空斑篩選實(shí)驗(yàn)中，篩選出4號(hào)BoIFN-λ3重組毒株最優(yōu)，測(cè)得其表達(dá)的BoIFN-λ3的效價(jià)可達(dá)(8.1±0.52)×105U/mL，表達(dá)量提高了3倍。本研究中，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為牛λ3干擾素的生產(chǎn)提供了一種新方法，并為深入研究BoIFN-λ3抗病毒活性及其機(jī)制，揭示其用于防冶牛病毒病的可行性提供了研究基礎(chǔ)。