李玉嬌, 吳光斌, 陳發(fā)河

集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 福建 廈門 361021

蓮霧(Syzygiumsamarangense)，桃金娘科(Myrtaceae)蒲桃屬(Syzygium)植物，又名洋蒲桃、水蒲桃等，是典型的熱帶果樹，原產(chǎn)于馬來半島及安達曼群島[1]，現(xiàn)在已被很多國家進行商業(yè)種植。蓮霧從17世紀開始引入中國，臺灣省最早進行試種[2]，如今已被廣東、廣西、福建、四川等地廣泛種植，近年來，蓮霧更是成為福建省的區(qū)域特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)[3]。蓮霧果實具有很高的營養(yǎng)價值，富含糖、蛋白質(zhì)、維生素C等營養(yǎng)成分[4]；同時，蓮霧還富含酚類、黃酮類物質(zhì)等抗氧化成分，具有抗菌、抗炎、清火、利尿、安神等功效，尤適于糖尿病患者食用，具有較高的藥用價值[5]。但是蓮霧果肉組織幼嫩，生命活動旺盛，采后極易衰老，不易貯運，短時間內(nèi)會發(fā)生絮狀綿軟、失水、軟化并腐爛，食用品質(zhì)急劇劣變，降低了其商品價值[6]。植物代謝組學(xué)技術(shù)為果蔬采后衰老機制和保鮮機理的研究提供了新的方法，已被廣泛應(yīng)用[7～10]，代謝組與基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組相比更接近生物體的表型，基因組和蛋白組的微小變化可以在代謝組層面得以體現(xiàn)和放大。

蓮霧果實采后保鮮和成熟衰老機制的研究在生理水平[11～16]及分子水平[17～19]上已經(jīng)有大量的研究，然而對于蓮霧果實在代謝組學(xué)基礎(chǔ)上的研究還鮮有報導(dǎo)。代謝物提取是代謝組學(xué)研究中最關(guān)鍵的一步，選擇合適的提取方法為后續(xù)利用代謝組學(xué)尋找采后蓮霧果實貯藏期間影響蓮霧成熟衰老的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物提供了有效的方法，有利于研究NO等保鮮劑對采后蓮霧的保鮮機制。

代謝組學(xué)研究常用到的提取溶劑有甲醇[20]、乙醇[21]、氯仿[22]、乙腈[23]等，以及各溶劑組合提取。不同試劑對代謝產(chǎn)物的提取會產(chǎn)生不同的影響，Gullberg等[24]建議使用單相MeOH-CHCl3-H2O(3∶1∶1)提取擬南芥中的代謝產(chǎn)物，然而對于同一組織，Danielsson等[25]報道了冷MeOH-H2O(1∶4)萃取能提供大量代謝物并具有更好的重復(fù)性。提取植物初級及次級代謝物應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌褂脝我坏幕蚨喾N溶劑組合。甲醇-水和甲醇-氯仿-水是植物代謝產(chǎn)物提取中應(yīng)用最廣泛的兩種方法，能提取糖、氨基酸和有機酸等小分子物質(zhì)，氯仿溶劑的極性遠小于甲醇和水溶劑，氯仿的添加有助于疏水脂類物質(zhì)的提取。本試驗以成熟期蓮霧果實為材料,進行非靶向代謝組學(xué)研究，查閱相關(guān)文獻后選擇提取溶劑甲醇-水(3∶1體積比)[26]和甲醇-氯仿-水(5∶2∶2體積比)[27]對蓮霧果實進行代謝產(chǎn)物提取，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對蓮霧果實代謝產(chǎn)物進行分離和鑒定，進而比較兩種方法對蓮霧果實代謝組學(xué)研究的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮霧果實，品種為臺灣“黑珍珠”(SyzygiumsamarangenseMerr.etPerry),購于廈門市水果集散中心。

甲醇(色譜純)購于德國CNW公司；氯仿(色譜純)購于Adamas公司；超純水；吡啶(色譜純)購于Adamas公司；甲氧胺鹽(AR)購于上海TCI公司；核糖醇(純度>99%)購于美國Sigma公司；N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅烷(BSTFA +1% TMCS)購于美國 Regis 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；Heraeus Fresco17離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PS-60AL超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)；JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司)；TNG-T98真空干燥儀(太倉市華美生化儀器廠)；DHG-9023A烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品處理 選擇大小相近、成熟度一致、無機械損傷和病蟲害的新鮮蓮霧，用小刀切割成均勻合適的小塊，迅速放入液氮冷凍處理至少15 min，分裝在自封袋中標(biāo)號，儲存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3.2樣品制備 樣品提取方法分為A法和B法。

A法：取60±1 mg蓮霧果實樣品于2 mL EP管中，加入0.48 mL甲醇提取液(甲醇水體積比=3∶1)，再加入20 μL核糖醇，渦旋30 s；向樣品管中加入瓷珠，在45 Hz研磨儀處理4 min，超聲5 min(冰水浴)；將樣本4℃離心，12 000 r/min離心15 min；移取55 μL上清液于2 mL進樣瓶(甲烷硅基化的)中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入80 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL)，輕輕混勻后，放入烘箱中80℃孵育30 min；向每個樣品中加入100 μL BSTFA(含有1% TMCS,V/V)，將混合物70℃孵育1.5 h；隨機順序上機檢測,3次重復(fù)。

B法：用甲醇-氯仿-水溶液(甲醇：氯仿：水=5∶2∶2，體積比)替換A法中的甲醇溶液，其他操作同A法，3次重復(fù)。

1.3.3色譜-質(zhì)譜分析條件 色譜條件：色譜柱：DB-5MS 毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣：氦氣；進樣模式：不分流；進樣量：1 μL；升溫程序：起始溫度：50℃，保持1 min， 以10℃/min 升溫至310℃。

質(zhì)譜條件：全掃描方式；離子源溫度250℃；溶劑延遲：6.27 min；質(zhì)量掃描范圍50～500 m/z。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用ChromaTOF軟件(V 4.3x，LECO)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等數(shù)據(jù)預(yù)處理，使用軟件SIMCA V14.1對數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。使用KEGG COMPOUND數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫等進行質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配代謝物質(zhì)進行定性，相對含量按面積歸一化法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出代謝物分析

兩種方法共檢測出302個峰，數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后與數(shù)據(jù)庫進行比對，共鑒定出129種代謝產(chǎn)物。這129種代謝產(chǎn)物主要包括糖類、有機酸、氨基酸，還有少數(shù)的醇類、酯類、酚類和有機胺類物質(zhì)。在本實驗中測得的代謝產(chǎn)物數(shù)量和種類十分可觀。

2.2 兩種提取方法的提取效果比較

對A法和B法各自檢測到的色譜峰數(shù)目進行數(shù)學(xué)統(tǒng)計，由圖1可知， A法平均檢測到色譜峰總數(shù)533個，B法平均檢測到色譜峰總數(shù)410個，A法提取到的色譜峰總數(shù)明顯多于B法。對兩種方法檢測到的色譜峰數(shù)目做顯著性分析，兩種方法能檢測到的色譜峰總數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)，把兩種方法的總離子色譜疊加分析顯示(圖2，彩圖見圖版五)，A法檢測到的色譜峰數(shù)目明顯多于B法，且A法的色譜峰強度也優(yōu)于B法。

2.3 兩種方法的PCA分析

PCA分析主要用于直觀上真實反應(yīng)各組樣本的空間分布，能夠從總體上反映各組樣本之間的總體代謝差異。對兩種不同提取液提取的兩組樣品的檢出峰面積數(shù)據(jù)進行無監(jiān)督的主成分分析，圖中圓形為A法提取的3個重復(fù)，記為A組，正方形為B法提取的3個重復(fù)，記為B組。從PCA得分圖(R2X=0.768)的結(jié)果可以看出，A組和B組的重復(fù)數(shù)據(jù)點相對集中，說明數(shù)據(jù)的質(zhì)量良好，可以繼續(xù)用于后續(xù)分析；而圓形和正方形分布于中間軸的兩側(cè)，說明兩組樣品組間差異顯著，兩種方法提取的代謝產(chǎn)物在數(shù)量、種類和濃度等方面都有顯著差異。

圖1 兩種方法提取的色譜峰數(shù)目Fig.1 Total peak numbers of the two extract methods.注：**表示方法B與方法A相比，色譜峰數(shù)目差異顯著(P<0.01)。

圖2 兩種方法的總離子色譜圖Fig.2 Stack of ion current chromatograms of the two methods.(彩圖見圖版五)

圖3 A法和B法的PCA得分散點圖Fig.3 Score scatter plot of PCA for the method A and B.

2.4 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

使用SIMCA軟件對兩種溶劑提取的數(shù)據(jù)進行OPLS-DA(R2X=0.687，R2Y=1，Q2=0.981)分析，如圖4，圖中圓形為方法A提取，正方形為方法B提取，從OPLS-DA得分圖的結(jié)果可以看出，兩組樣本分別位于坐標(biāo)兩側(cè)，兩組樣本的區(qū)分非常顯著，正方形與圓形相比較分散，說明方法B提取的樣本組內(nèi)差別相對方法A較大，不同溶劑對代謝物提取有很大的影響。

圖4 A法對B法的OPLS-DA 模型得分散點圖Fig.4 Score scatter plot of OPLS-DA for model group A vs B.

2.5 差異代謝物分析

對兩組樣本的數(shù)據(jù)進行單變量統(tǒng)計分析，可以觀察代謝物水平的獨立變化，本實驗采用OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)大于1，同時滿足t檢驗的P<0.05來尋找差異性代謝物。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，A法和B法提取的代謝產(chǎn)物差異顯著，兩種方法共檢測到302種物質(zhì)，差異顯著的代謝物共有124個，共鑒定出40個代謝物(表1)。由表1觀察到，40個代謝物中，A組峰面積相對含量顯著高于B組的物質(zhì)共有28個，相似度大于500的22個代謝物質(zhì)中有15個；在這些差異代謝物中，蔗糖、葡萄糖-1-磷酸和尿嘧啶的峰面積相對含量最大，這3種物質(zhì)用A法提取的含量都高于B法。

將篩選差異代謝物的結(jié)果以火山圖(volcano plot)的形式進行可視化，圖5(彩圖見圖版六)為A組對B組的差異代謝物篩選火山圖，火山圖中每個點代表一個代謝物，散點大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點越大VIP值越大，VIP值越大該物質(zhì)在兩組間的含量差異越大。紅色點表示代謝產(chǎn)物顯著上調(diào)(A組相對含量顯著大于B組)，藍色點表示代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)(B組相對含量顯著大于A組)，灰色為非顯著差異的代謝物。在圖5中，顯著上調(diào)的物質(zhì)有90個，只有34個物質(zhì)顯著下調(diào)。

綜上所述，A法提取在數(shù)量上顯著多于B法提取，適合用于非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究。

3 討論

植物中的代謝物約20萬～100萬種[28]，且不同組織中代謝物的種類和含量差異較大，沒有一種提取方法能夠同時提取所有代謝物質(zhì)，非靶向代謝組學(xué)致力于能分析到盡可能多的代謝物質(zhì)。代謝產(chǎn)物的提取是代謝組學(xué)分析最關(guān)鍵的一步，合適的方法是獲得可靠結(jié)果的保證，不同提取試劑適合提取的產(chǎn)物不同，因此提取試劑的選擇尤為重要。本研究選取了甲醇-水提取法(A)和甲醇-氯仿-水法(B)兩種植物代謝組常用的提取溶劑對蓮霧果實代謝產(chǎn)物進行比較全面的檢測及研究，旨在選出適合蓮霧代謝組學(xué)研究的方法，為進一步找出與蓮霧果實衰老相關(guān)的代謝物質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表1 差異代謝物鑒定Table 1 Identification of differentially expressed metabolites.

圖5 A組對B組的差異代謝物篩選火山圖Fig.5 Volcno plot of differentially expressed metabolites screening for group A vs B.(彩圖見圖版六)

李思釩等[29]在水稻種子代謝產(chǎn)物提取實驗的研究中比較了甲醇-水和甲醇-氯仿-水兩種提取溶劑，發(fā)現(xiàn)甲醇-水提取液對代謝物種類沒有偏向性；于倩等[30]對具槽帕拉藻代謝組提取方法進行比較發(fā)現(xiàn)雖然甲醇-氯仿-水提取方法能夠同時提取親水和疏水代謝物，但提取效率較低，而甲醇-水溶劑體系能實現(xiàn)對大多數(shù)代謝物的提取。本研究以GC-MS為代謝物分析方法對兩種方法進行比較，發(fā)現(xiàn)從提取的色譜峰數(shù)目和信號強度方面來看，A法提取均優(yōu)于B法提取。從代謝產(chǎn)物種類上比較，雖然兩種方法都能檢測出氨基酸、糖、有機酸等小分子物質(zhì)，符合非靶向GC-MS檢測對象物質(zhì)，但是B法的提取效率低，從檢出數(shù)量和相對物質(zhì)含量上比較，A法的代謝產(chǎn)物數(shù)量和濃度比B法提取的多，A法更適合用于蓮霧果實代謝產(chǎn)物提取,這與已有研究結(jié)果[29,30]相似。

甲醇-氯仿-水體系提取更偏好脂類等疏水代謝產(chǎn)物[31]，而蓮霧中糖類、氨基酸和有機酸等親水性小分子種類較多。Danielsson等[25]比較了衣藻中5種提取溶劑，結(jié)果認為在萃取溶劑中使用氯仿對于代謝產(chǎn)物提取起反作用。綜上所述，不同溶劑提取蓮霧果實代謝物會影響蓮霧果實代謝產(chǎn)物的種類、數(shù)量和相對含量，甲醇-水提取比甲醇-氯仿-水提取更適合用于采后蓮霧果實的代謝組學(xué)研究。