呂 敏, 陶衛(wèi)春, 康海全, 李立新, 陳 濤

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州 225009;3.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心, 哈爾濱 150040;

在植物生長發(fā)育過程中，細(xì)胞的分裂與分化被嚴(yán)格調(diào)控。與動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的形態(tài)建成過程不同，植物的形態(tài)建成主要由分生組織在生長發(fā)育過程中決定。因此分生組織細(xì)胞的持續(xù)分裂能力在整個(gè)植物生活史中占有首要地位[1]。細(xì)胞周期是細(xì)胞完成整個(gè)一系列分裂過程的總稱。分為間期(interphase)和分裂期(mitotic phase)。其中間期又分為G1期、S期和G2期；分裂期又分為前期(prophase)、中期(petaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)[2]。

細(xì)胞的分裂與增殖受到進(jìn)化上保守的分子機(jī)制所控制。在不同物種中的調(diào)控機(jī)制基本相同，其中細(xì)胞周期蛋白(cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)是主要參與者[3]。因此，真核生物進(jìn)化出了精巧的CDK活性調(diào)控機(jī)制，對CDK的不可逆調(diào)控主要是降解cyclin亞基。在G1期-S期轉(zhuǎn)換和中期-后期轉(zhuǎn)換時(shí)，通過對cyclin的泛素降解達(dá)到對CDK激酶活性的不可逆失活[4,5]。泛素-蛋白酶體降解途徑需要各種E3連接酶的參與，其中后期促進(jìn)復(fù)合體(anaphase-promoting complex，APC)發(fā)揮重要作用。APC蛋白復(fù)合體由11個(gè)亞基組成，在真核生物中都非常保守，包括植物界和動(dòng)物界[6]。APC蛋白復(fù)合體在有絲分裂、減數(shù)分裂、G1期-S期轉(zhuǎn)換、中期-后期轉(zhuǎn)換以及有絲分裂后的細(xì)胞分化都有至關(guān)重要的作用[7]。雖然APC蛋白復(fù)合體在控制細(xì)胞周期中的分子機(jī)制已研究的非常清楚，但是其如何調(diào)控植物側(cè)根發(fā)生仍然所知甚少[8]。

植物的根系統(tǒng)對植物的許多生長發(fā)育過程都至關(guān)重要，包括：養(yǎng)分及水分的吸收、錨定及機(jī)械支撐、營養(yǎng)貯存功能等，它同時(shí)也是植物和土壤環(huán)境中的生物脅迫因子和非生物脅迫因子相互作用的主要界面[9]。從根系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)上講，單子葉植物和雙子葉植物有很大差別，由主根和側(cè)根組成的根系統(tǒng)是雙子葉植物的主要特征[10]。側(cè)根的發(fā)生起源于主根的一小團(tuán)中柱鞘細(xì)胞，稱為生成細(xì)胞(founder cell)，生成細(xì)胞分化成為側(cè)根原基并向外生長突破內(nèi)皮層、皮層和表皮，直至形成可見的側(cè)根。側(cè)根的發(fā)生受生長素的調(diào)控，同時(shí)也受到外界環(huán)境的影響[11,12]。

生長素作為最早被發(fā)現(xiàn)的植物激素，在植物的生長發(fā)育過程當(dāng)中發(fā)揮著重要作用。IAA是其最主要的活性成分，植物體內(nèi)合成IAA的途徑主要是依賴于色氨酸的途徑，SUR1、SUR2/CYP83B1、CYP79B2、CYP79B3、YUCCA、NIT1、NIT2、NIT3、NIT4等是重要的合成調(diào)控基因[13,14]。生長素運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制主要有兩種：一種是通過生長素運(yùn)輸?shù)鞍椎臉O性運(yùn)輸，依賴于AUX1以及PIN蛋白，一種是通過調(diào)節(jié)胞間連絲通透性的運(yùn)輸方式[15]。生長素的信號途徑包括：TIR1結(jié)合生長素分子并與CUL1、RBX1和ASK1/ASK2形成SCF復(fù)合體，催化泛素從泛素連接酶E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白AUX/IAA上，泛素化的AUX1/IAA進(jìn)入26S蛋白酶復(fù)合體降解，從而釋放了轉(zhuǎn)錄因子ARF的活性，啟動(dòng)生長素早期應(yīng)答基因GH3、SAUR等的表達(dá)[16～19]。

本研究利用雙子葉模式植物擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，篩選EMS突變體庫得到1個(gè)根發(fā)育異常的突變體dig9(drought inhibition of lateral root growth)，通過圖位克隆方法定位并克隆了DIG9基因，該突變體編碼一個(gè)細(xì)胞周期后期促進(jìn)復(fù)合體組分(anaphase-promoting complex，APC)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DIG9定位于細(xì)胞核并在根中高表達(dá)。外施生長素可以恢復(fù)側(cè)根表型。研究結(jié)果表明DIG9可能通過影響生長素的合成來調(diào)控植物的根發(fā)育。本研究為細(xì)胞周期蛋白如何通過生長素調(diào)控根發(fā)育提供了新的證據(jù)和研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所用材料為十字花科植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞(Columbia)生態(tài)型Col以及擬南芥突變體dig9。 將成熟的擬南芥種子經(jīng)75%酒精消毒10 min，然后用滅菌水沖洗4遍后播種于1/2 MS培養(yǎng)基中。4℃避光春化3 d，然后將培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中(光周期16 h/8 h，溫度22℃)培養(yǎng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 瓊脂糖、pENTR-D-TOPO載體、LR酶購自Invitrogen公司；內(nèi)切酶EcoRⅠ購自NEB公司；KOD高保真酶購自TOYOBO公司；AccuRT Reaction Mix、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒5×All in-one-RT Master Mix購自ABM公司；凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；IAA購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 東勝創(chuàng)新PCR儀、Bio-Rad電泳系統(tǒng)、天能凝膠成像系統(tǒng)1600、Eppendorf 5424離心機(jī)、Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī)、尼康D610相機(jī)、尼康體視鏡SMZ745T、蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM510、FEI 透射電子顯微鏡Tecnai G2 Spirit 120Kv。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1擬南芥表型數(shù)據(jù)收集 將4 d的擬南芥幼苗移到豎直培養(yǎng)基上，每天拍照收集野生型Col和dig9突變體的表型。用Image J軟件量化根長和側(cè)根數(shù)。7 d的dig9突變體轉(zhuǎn)移到蛭石中，觀察整個(gè)生活周期并拍照記錄。

1.2.2DIG9基因的克隆 將dig9突變體與生態(tài)型Ler雜交，F(xiàn)2代群體中挑選與dig9表型一致的個(gè)體共150個(gè)。采取圖位克隆的方法，先用染色體粗定位標(biāo)記(引物序列見表1)，確定染色體后再用精細(xì)定位的標(biāo)記(引物序列見表1)直至把區(qū)間縮小到50 kb，再進(jìn)行測序找到突變位點(diǎn)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study.

1.2.3qRT-PCR檢測DIG9基因及ARF基因的表達(dá) 對于DIG9基因，取14 d幼苗的地下部分和地上部分、成苗的根、莖、葉、花、莢等組織，用Trizol法分別提取各組織的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以擬南芥ACTIN2作為內(nèi)參，用半定量RT-PCR方法進(jìn)行DIG9基因表達(dá)量分析(引物序列見表1)。以幼苗地下部分表達(dá)量為1進(jìn)行歸一化處理。對于ARF基因，取擬南芥Col與dig9突變體14 d幼苗的根，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，以擬南芥ACTIN2作為內(nèi)參，用半定量RT-PCR方法進(jìn)行ARF基因表達(dá)量分析(引物序列見表1)。

1.2.4DIG9蛋白的結(jié)構(gòu)及序列分析 將DIG9蛋白序列輸入蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件Phyre2，提交任務(wù)并完成后下載結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。從TAIR(www.arabidopsis.org)網(wǎng)站下載APC復(fù)合體的各個(gè)組分序列，用DNASTAR 7.0進(jìn)行序列比對及聚類分析。將DIG9蛋白序列在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行模式生物中的同源性比對，將所有模式生物的同源序列下載后用DNASTAR 7.0進(jìn)行序列比對及聚類分析并標(biāo)記出突變位點(diǎn)的位置。

1.2.5DIG9蛋白亞細(xì)胞定位 將DIG9基因全長克隆到pENTR-D-TOPO入門載體，并用LR反應(yīng)克隆到帶GFP標(biāo)簽的載體CD3-688中得到DIG9-GFP融合載體DIG9-688。大量提取DGI9-688質(zhì)粒，并按照Yoo等[20]的擬南芥原生質(zhì)體制備及PEG瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，將DIG9-688轉(zhuǎn)化入擬南芥原生質(zhì)體并在室溫孵育16 h，然后再激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP信號。

1.2.6DIG9表達(dá)譜分析 將DIG9啟動(dòng)子全長克隆入pENTR-D-TOPO入門載體，并用LR反應(yīng)克隆到帶GUS標(biāo)簽的載體pMDC-162中得到DIG9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告載體PDIG9-162。將PDIG9-162轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并轉(zhuǎn)入擬南芥，在含有潮霉素的平板上篩選抗性轉(zhuǎn)基因植株。將陽性植株進(jìn)行GUS染色，檢測DIG9啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)活性。

1.2.7dig9突變體外施IAA及逆境脅迫分析

分別配制不同IAA濃度(0、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)的豎直板、模擬干旱的不同濃度甘露醇(mannitol)(0、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L)的豎板和模擬鹽環(huán)境的不同濃度NaCl(0、60 mmol/L、120 mmol/L、150 mmol/L)的豎板。將4 d的擬南芥幼苗移到豎直培養(yǎng)基上，每天拍照收集野生型和dig9突變體的表型。用Image J軟件量化根長和側(cè)根數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 dig9突變體的分離與根觀察

為了研究逆境脅迫與根發(fā)育的關(guān)系，我們建立了根表型篩選系統(tǒng)，對擬南芥生態(tài)型Col進(jìn)行EMS誘變，構(gòu)建突變體庫并篩選根發(fā)育異常的突變體[21,22]。我們從中分離出1株主根短且側(cè)根少的突變體，命名為droughtinhibitionoflateralrootgrowth9(dig9)。相對于野生型Col，dig9突變體在幼苗階段顯示出主根發(fā)育遲緩和極少量側(cè)根的表型(圖1A、B,彩圖見圖版二)。如圖1C統(tǒng)計(jì)顯示，4～12 d的幼苗，相較于Col的根快速生長，dig9突變體的根生長緩慢；同時(shí)對12 d的幼苗進(jìn)行平均側(cè)根數(shù)(每厘米主根上的平均側(cè)根數(shù))測量發(fā)現(xiàn)，Col的平均側(cè)根數(shù)為1.7個(gè)/cm，而dig9的平均側(cè)根數(shù)僅為0.2個(gè)/cm，差異達(dá)極顯著水平(圖1D)。

2.2 dig9突變體的其他發(fā)育表型

將7 d的dig9幼苗移到蛭石中，觀察整個(gè)生活周期。發(fā)現(xiàn)dig9的葉片扭曲，且有不規(guī)則鋸齒狀邊緣(圖2A,彩圖見圖版二)。dig9的主莖很短，株高僅2 cm左右，莢從蓮座中心基部生長(圖2B，紅箭頭指示莢的位置)。待結(jié)莢成熟時(shí)，從蛭石中取出Col和dig9的整個(gè)植株觀察。如圖2C所示，dig9地上部分矮小，蓮座葉不伸展且扭曲；dig9地下部分主根短且側(cè)根少，整體上根總量明顯少于野生型Col。

我們還觀察了頂端分生組織SAM的生長狀況。如圖3A、B(彩圖見圖版二)所示，7 d幼苗在體視鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，dig9發(fā)育明顯遲緩；相較于已長出四片真葉的Col，dig9還停留在兩片小真葉階段，且子葉片和真葉片發(fā)黃，顯示可能葉綠體遭到破壞。掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，dig9的頂端分生組織還沒有完全形成，這是dig9發(fā)育遲緩的主要原因(圖3C～F)。

2.3 DIG9基因的圖位克隆

為了定位和克隆DIG9基因，我們將dig9突變體與另一生態(tài)型Ler(Landsbergerecta)雜交，F(xiàn)1代自交后獲得到F2代群體，F(xiàn)2代與dig9突變體表型相同的占整個(gè)群體約25%，說明DIG9是一個(gè)隱性核基因。在F2群體中挑選150株與dig9表型相同的個(gè)體，分別提取基因組DNA并取出5 μL進(jìn)行混池，用染色體粗定位標(biāo)記將DIG9基因定位于3號染色體，然后對個(gè)體的基因組DNA用精細(xì)定位標(biāo)記，將DIG9基因鎖定在BAC克隆T24C20上的50 kb區(qū)間，對此區(qū)間進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)基因AT3G48150的外顯子上發(fā)生G-A突變，導(dǎo)致AT3G48150編碼的蛋白309位氨基酸Asp突變?yōu)锳sn(圖4A，彩圖見圖版三)。

圖1 dig9突變體根表型分析Fig.1 The root phenotypes of dig9 mutant.A：移苗后第1天(D1)的幼苗生長情況；B：移苗后第8天(D8)的幼苗生長情況；C：D1～D8根生長統(tǒng)計(jì)；D：D8幼苗的每厘米根長平均側(cè)根數(shù)統(tǒng)計(jì)，**代表差異極顯著(P<0.01) 。(彩圖見圖版二)

圖2 dig9突變體發(fā)育表型分析Fig.2 The developmental phenotypes of dig9 mutant.A：dig9突變體在蛭石中的生長狀況；B：dig9突變體的無主莖及莢生長表型，紅箭頭指示莢；C：成熟期Col與dig9的整株對比。 (彩圖見圖版二)

圖3 dig9突變體頂端分生組織SAM表型分析Fig.3 The SAM phenotypes of dig9 mutant.A、C、E：野生型Col；B、D、F：dig9突變體；A、B：體視鏡下10 d的幼苗；C、D：掃描電鏡下10 d的幼苗；E、F：透射電鏡下10 d的幼苗，方框指示SAM位置。(彩圖見圖版二)

2.4 DIG9蛋白的結(jié)構(gòu)及特性分析

DIG9基因編碼一個(gè)細(xì)胞周期后期促進(jìn)因子組分APC8 (anaphase-promoting complex 8)。通過SMART預(yù)測DIG9的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)TPR(tetratricopeptide repeat)重復(fù)結(jié)構(gòu)，是一類TPR蛋白(圖4B)。用Phyre2蛋白結(jié)構(gòu)軟件模擬DIG9，發(fā)現(xiàn)DIG9蛋白幾乎全部由α螺旋組成，這與其TPR基序結(jié)構(gòu)一樣(圖4C)。為了鑒定dig9突變體是否真的在T3G48150的外顯子上發(fā)生G-A突變，我們用單核苷酸多態(tài)性分析(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)方法對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證，如圖4D所示，dig9的PCR產(chǎn)物能被EcoRⅠ切割而Col不能，證明dig9內(nèi)確實(shí)發(fā)生了此突變。

圖4 DIG9的圖位克隆及蛋白特性分析Fig.4 Map-based cloning and protein characterization of DIG9.A：dig9突變體的圖位克隆；B：DIG9蛋白的保守結(jié)構(gòu)域SMART分析；C：DIG9蛋白的三級結(jié)構(gòu)Phyre2預(yù)測；D：dCAPS驗(yàn)證dig9的突變位點(diǎn)。(彩圖見圖版三)

APC蛋白復(fù)合體在整個(gè)真核生物中都很保守，由11個(gè)亞基組成。我們將擬南芥中的11個(gè)亞基進(jìn)行歸類分析，發(fā)現(xiàn)APC3-1、APC3-2、APC6、APC7、APC8歸為一類且都屬于TPR蛋白(圖5A)。我們從NCBI數(shù)據(jù)庫尋找DIG9/APC8在其他模式生物中的同源序列，進(jìn)行序列比對和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)植物和動(dòng)物在進(jìn)化上歸為兩類。擬南芥、大豆、水稻(XP_015622608.1)、玉米(NP_001147126.1)歸為一類，而人(NP_004652.2)、小鼠(NP_848124.1)、大鼠(NP_001094129.1)、兔子(NP_497203.1)、非洲爪蟾(NP_001079890.1)、斑馬魚、蚊子(XP_319000.3)、果蠅(NP_610036.2)

圖5 DIG9的序列比、進(jìn)化樹對及突變位點(diǎn)分析Fig.5 Sequence alignment, phylogenic tree and mutant site analysis of DIG9.A：擬南芥中APC蛋白的序列比對；B：模式生物中DIG9/APC8同源蛋白的進(jìn)化樹分析；C：模式生物中DIG9/APC8的突變位點(diǎn)保守性分析?！啊铩北硎颈Ｊ匚稽c(diǎn)。

歸為一類(圖5B)。進(jìn)而查看dig9的突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)在整個(gè)模式生物中很保守，說明此位點(diǎn)突變影響DIG9/APC8蛋白的活性，進(jìn)而影響其功能。

2.5 DIG9蛋白的亞細(xì)胞定位

蛋白定位對于蛋白行使功能有重要意義。我們將DIG9基因構(gòu)建到帶GFP標(biāo)簽的載體中，用原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法將構(gòu)建好的載體與核定位標(biāo)記-RFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入擬南芥原生質(zhì)體。在激光共聚焦顯微鏡下檢測GFP和RFP信號并與明場信號重疊。如圖6A～D(彩圖見圖版三)所示，DIG9與核定位標(biāo)記共定位于細(xì)胞核。

2.6 DIG9的時(shí)空表達(dá)分析

基因發(fā)揮功能需要在特定的時(shí)空中表達(dá)。我們在幼苗和成熟植株各組織中檢測了DIG9的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)DIG9在成苗的根中大量表達(dá)。暗示DIG9控制植物的根發(fā)育(圖6E)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DIG9的時(shí)空表達(dá)結(jié)果，我們克隆了DIG9的啟動(dòng)子并構(gòu)建啟動(dòng)子-GUS報(bào)告載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法得到轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過GUS染色檢測DIG9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)情況。如圖6F～I(xiàn)所示，DIG9啟動(dòng)子在根部活性最強(qiáng)，尤其是根尖和側(cè)根處，同時(shí)在頂端分生組織SAM處也有較強(qiáng)的表達(dá)。說明DIG9/APC8蛋白調(diào)控了根發(fā)育和地上部分的組織器官分化。

圖6 DIG9的亞細(xì)胞定位及時(shí)空表達(dá)分析Fig.6 DIG9 subcellular localization and temporal-spatial expression analysis.A～D：DIG9的亞細(xì)胞定位；E：DIG9在不同組織中的表達(dá)量分析；F～I(xiàn)：DIG9的啟動(dòng)子-GUS活性分析。(彩圖見圖版三)

2.7 IAA對dig9突變體側(cè)根表型的影響

生長素在調(diào)控根發(fā)育上具有至關(guān)重要的作用。我們將4 d的Col和dig9幼苗放在不同IAA濃度的豎直MS培養(yǎng)基上，8 d后觀察IAA對植物根部的影響。如圖7A～D(彩圖見圖版四)所示，IAA能降低主根的生長速度并增加側(cè)根的生長。明顯看出，隨著IAA濃度的增加，突變體的側(cè)根表型得到恢復(fù)，但是主根的生長一直沒有恢復(fù)(圖7E、F)。所以，IAA能特定地恢復(fù)dig9側(cè)根少的表型。對12 d的幼苗，取根部檢測生長應(yīng)答基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在dig9突變體中，ARF5、ARF7、ARF19等在側(cè)根發(fā)生過程中起重要作用的基因表達(dá)量均顯著地受到抑制(圖7G)。以上結(jié)果表明dig9側(cè)根少的表型主要是由于生長素的信號弱引起的，而外施IAA能恢復(fù)dig9的側(cè)根。

2.8 逆境脅迫對dig9突變體的影響

由于dig9突變體分離自逆境脅迫對植物側(cè)根發(fā)育影響(drought inhibition of lateral root growth)的突變體庫。我們分析了模擬干旱脅迫以及鹽脅迫對dig9突變體的影響。如圖8A～F(彩圖見圖版四)所示，甘露醇處理的擬南芥幼苗能降低Col主根的生長速度但不改變側(cè)根密度；而對于dig9，干旱處理幾乎不改變其主根生長速度，但能顯著增加側(cè)根密度。鹽脅迫處理時(shí)，Col的主根生長速度降低但側(cè)根密度增加；而對于dig9，鹽處理對其主根生長速度以及側(cè)根發(fā)生幾乎沒有影響(圖9A～F，彩圖見圖版五)。暗示細(xì)胞周期基因在植物應(yīng)對逆境脅迫時(shí)也有一定作用。

3 討論

根系是植物賴以生長發(fā)育的重要器官。植物吸收周圍環(huán)境的營養(yǎng)元素和物質(zhì)必須通過根的吸收和運(yùn)輸。因此研究根的發(fā)育不但能夠拓展人類對植物基本理論的認(rèn)知，而且對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有至關(guān)重要的意義。

根的發(fā)育受到諸多因素影響，本研究通過篩選根發(fā)育異常突變體，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期的后期促進(jìn)復(fù)合體組分DIG9/APC8參與了植物根的發(fā)育。DIG9/APC8蛋白的保守氨基酸Asp309突變，導(dǎo)致了其功能的弱化。dig9突變體植株有許多嚴(yán)重的發(fā)育突變表型，包括根的發(fā)育遲緩以及蓮座葉的扭曲及主莖發(fā)育異常等。外施IAA能恢復(fù)dig9的側(cè)根表型，說明DIG9通過IAA影響了植物的側(cè)根發(fā)生。Zheng等[23]通過篩選dcl1-14的增強(qiáng)表型來篩選出參與miRNA生物發(fā)生過程的突變體時(shí)，也篩到了APC8。其突變位點(diǎn)與dig9一致，說明DIG9/APC8功能重要且此位點(diǎn)易被EMS誘變。綜合來看，APC8不但參與了細(xì)胞周期調(diào)控，也參與了miRNA生物的發(fā)生過程，同時(shí)還通過生長素調(diào)控植物的側(cè)根發(fā)育，說明DIG9/APC8有多方面的功能。

圖7 外施IAA對dig9突變體側(cè)根表型的影響Fig.7 Effects of adding exogenous IAA on lateral root phenotype of dig9.A～D：Col和dig9在不同濃度IAA培養(yǎng)基上的生長狀況；E：不同濃度IAA下平均側(cè)根數(shù)統(tǒng)計(jì)；F：不同濃度IAA下根長統(tǒng)計(jì)；G：生長素響應(yīng)基因在Col和dig9中的表達(dá)量分析。*和**表示與Col組相比在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。(彩圖見圖版四)

圖8 dig9突變體的干旱脅迫試驗(yàn)Fig.8 The drought treatment of dig9 mutant.A～D：Col和dig9在不同濃度甘露醇培養(yǎng)基上的生長狀況；E：不同濃度甘露醇下根長統(tǒng)計(jì)； F：不同濃度甘露醇下平均側(cè)根數(shù)統(tǒng)計(jì)。(彩圖見圖版四)

圖9 dig9突變體的鹽脅迫試驗(yàn)Fig.9 The salt treatment of dig9 mutant.A～D：Col和dig9在不同濃度NaCl培養(yǎng)基上的生長狀況；E：不同濃度NaCl下根長統(tǒng)計(jì)； F：不同濃度NaCl下平均側(cè)根數(shù)統(tǒng)計(jì)。(彩圖見圖版五)

其他APC組分的突變也會(huì)引起植物的發(fā)育異常，尤其是根的發(fā)育異常。例如APC3/HOBBIT基因發(fā)生突變，植物幾乎沒有根[24,25]。側(cè)根的發(fā)生需要中柱鞘細(xì)胞的分化，而這其中細(xì)胞周期的調(diào)控起到至關(guān)重要的作用。在IAA14突變體slr1中APC8的表達(dá)量上升，而即使在slr1中過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白CYCD3;1也不能引起互補(bǔ)slr1的無側(cè)根表型，說明細(xì)胞周期與側(cè)根發(fā)生的信號交叉極其復(fù)雜[26]。生長素是植物形態(tài)建成的重要激素，本研究首次將DIG9/APC8蛋白與植物的側(cè)根發(fā)生聯(lián)系起來，從而將細(xì)胞周期與激素應(yīng)答聯(lián)系起來。