李青春,薛軍花,李文革,邢國強(qiáng)

(陜西省渭南市第一醫(yī)院 普外科,陜西 渭南,714000)

大腸癌包括結(jié)腸癌、直腸癌，是常見的惡性消化道腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在英美等發(fā)達(dá)國家中，大腸癌是男性第3位常見腫瘤，僅次于肺癌和前列腺癌，而在女性中是第2位常見腫瘤，僅次于乳腺癌[1-2]。大腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，癌基因的激活與抑癌基因的失活，信號(hào)通路的改變，生活環(huán)境，飲食結(jié)構(gòu)的變化都可能誘導(dǎo)其發(fā)生[1-2]。臨床研究[3]證實(shí)，早期大腸癌患者5年生存率可達(dá)90%,但晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移者5年生存率僅為15%。本研究探討HoxB3在大腸癌細(xì)胞增殖凋亡中的作用機(jī)制，并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、Western blot及RT-PCR來進(jìn)一步驗(yàn)證其是否是miR-224的靶基因，以及miR-224影響大腸癌細(xì)胞增殖凋亡的可能機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株: 大腸癌HCT 116,RKO,SW 480,Caco-2,LoVo,HT-29細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號(hào)分別為: TCHu 99,TCHu 116,TCHu 172,TCHu 146,TCHu 82,TCHu 103;人正常結(jié)腸直腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器: 兔抗CDCA 3,CyclinD 1,p21,p27單克隆抗體(Epitmics公司);兔抗HoxB3多克隆抗體(Abcam公司);四甲基偶氮唑鹽(Gibco公司);胎牛血清,RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)。野生型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Wt,突變型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Mut,pcDNA 3.1-HoxB3,pcDNA 3.1-NC(Invitrogen公司);miR-224 inhibitor及miR-224 NC(廣州市銳博生物科技有限公司)。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠);ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司);熒光素酶活性檢測系統(tǒng)Dual-Luciferase Reporter System(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞活力: 將細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor,miR-224 NC,pcDNA 3.1-HoxB3及pcDNA 3.1-NC。48 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO,震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測OD值，以630 nm作為參比波長計(jì)算相對(duì)增殖率[4]。

1.2.2 AnnexinV-PI流式雙染檢測細(xì)胞凋亡: 將細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor,miR-224 NC,pcDNA 3.1-HoxB3及pcDNA 3.1-NC。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，并進(jìn)行上機(jī)檢測。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，用0.25%的胰蛋白酶消化,PBS洗滌,2 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min,收集細(xì)胞;按順序分別加入500 μL Binding Buffer,5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI 5,混勻，于室溫避光反應(yīng)10 min,在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn): 將細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor,miR-224 NC,轉(zhuǎn)染達(dá)到48 h后，消化細(xì)胞，避光上機(jī)檢測。加入70%乙醇，輕輕吹打混勻,4 ℃固定2 h,1 000 轉(zhuǎn)/min,離心5 min。PBS重懸并離心，加入0.5 mL PI染色液，重懸細(xì)胞,37 ℃避光反應(yīng)30 min,上機(jī)檢測。

1.2.4 RT-PCR: 參考trizol試劑盒(Invitrogen)使用說明書提取總RNA,整個(gè)提取處于無核糖核酸酶(RNAase)的環(huán)境下。引物如下: miR-224上游引物: 5′-GAGCCCAAGTCACTAGTGGT-3′,下游引物: 5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;HoxB3上游引物: 5′- GAATTCATGCAGAAAGCCACCTACTAC-3′,下游引物: 5′- CTCGAGTCACAGGTGTGTTAATTTG-3′;GADPH上游引物: 5′- AGCCACATCGCTCAGACA-3′,下游引物: 5′- TGGACTCCACGACGTACT-3′。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s,59 ℃復(fù)性45 s,72 ℃延伸60 s,共35個(gè)循環(huán)。

1.2.5 Western blot: 在收集到的細(xì)胞中，加入適量的RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s,40 min后,4 ℃、10 000轉(zhuǎn)/min離心10 min,小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育,4 ℃過夜;漂洗后，浸入二抗溶液(1∶100)中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Quantity one軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析: miR-224及HoxB3重組載體共轉(zhuǎn)染到HCT 116細(xì)胞中。分組如下: miR-224 inhibitor+Wt HoxB3,miR-224 NC+ Wt HoxB3,miR-224 inhibitor+Mut HoxB3,miR-224 NC+ Mut HoxB3。應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染好的熒光素酶活性，步驟如下: PBS洗滌3次，加入PLB裂解液，充分裂解后加入LAR溶液，雙報(bào)告系統(tǒng)熒光素酶檢測儀讀取熒光值，加入終止液，再次讀取熒光值，計(jì)算相對(duì)熒光值。計(jì)算公式: 相對(duì)熒光值=螢火蟲熒光素梅熒光值/海腎熒光素梅熒光值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-224在大腸癌細(xì)胞株及人正常結(jié)腸直腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC的表達(dá)

通過RT-PCR證實(shí)，大腸癌HCT 116、RKO、SW480、Caco-2、LoVo、HT-29細(xì)胞中miR-224的表達(dá)比值依次為(1.01±0.11)、(0.74±0.04)、(0.71±0.05)、(0.72±0.02)、(0.85±0.02)、(0.76±0.11),顯著高于人正常結(jié)腸直腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC的表達(dá)比值(0.20±0.02),其中在HCT116中的表達(dá)量最高，選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

2.2 miR-224 inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞活力和凋亡的影響

HCT 116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor后，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01)。經(jīng)AnnexinV-PI實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著上升。見圖1、2。

與miR-224 NC組比較, ??P<0.01。圖1 miR-224 inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響

圖2 miR-224 inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

2.3 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析

將miR-224 inhibitor、miR-224 NC及野生型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Wt及突變型載體pGL 3- HoxB3 3′UTR-Mut轉(zhuǎn)入HCT 116細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224 inhibitor與野生型載體pGL 3- HoxB3 3′UTR-Wt共轉(zhuǎn)染組的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著弱于其他轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。對(duì)于突變型載體pGL 3-HoxB3 3′UTR-Mut,各組間熒光強(qiáng)度無顯著差異(P>0.05),見圖3。

與miR-224 NC組比較, ??P<0.01。圖3 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析

2.4 miR-224 inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞中HoxB3蛋白及mRNA表達(dá)的影響

將miR-224 inhibitor、miR-224 NC轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞后,HoxB3蛋白及mRNA表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)。見圖4。

與miR-224 NC組比較,**P<0.01。

圖4miR-224inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞中HoxB3蛋白及mRNA表達(dá)的影響

2.5 HoxB3表達(dá)下調(diào)后對(duì)HCT 116細(xì)胞活力和凋亡的影響

HCT 116細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-HoxB3及pcDNA 3.1-NC后，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01)。經(jīng)AnnexinV-PI實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著上升。說明miR-224 inhibitor或者siRNA都能抑制HoxB3表達(dá)，從而降低大腸癌HCT 116細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖5、6。

與pcDNA 3.1-NC組比較, ??P<0.01。圖5 HoxB3表達(dá)下調(diào)后對(duì)HCT 116細(xì)胞活力的影響

圖6 HoxB3表達(dá)下調(diào)后對(duì)HCT 116細(xì)胞凋亡的影響

2.6 miR-224 inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

HCT 116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor后，能使HCT 116細(xì)胞周期阻滯在G1期。見圖7。

圖7 miR-224 inhibitor對(duì)HCT 116細(xì)胞周期的影響

2.7 miR-224 inhibitor對(duì)HCT116細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

HCT 116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-224 inhibitor后，能顯著下調(diào)細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白3(CDCA3)及細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達(dá)，上調(diào)p21及p27表達(dá)。見圖8、9。

3 討 論

大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過程，最終表現(xiàn)為癌基因的激活和抑癌基因的失活。研究[5]證實(shí)miRNAs在大腸癌的早期診斷、臨床分期中具有顯著標(biāo)記性，在多種腫瘤中異常表達(dá)，與包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs是一類進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,它能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而抑制靶基因表達(dá)。研究[6]顯示miR-224參與多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分化、增殖、凋亡及細(xì)胞周期等生物學(xué)過程。在肝癌、乳腺癌及結(jié)腸癌瘤組織中miR-224的表達(dá)都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)[6]。也有少量研究[7-11]證實(shí)大腸癌組織中miR-224的表達(dá)顯著高于正常癌旁組織，并作為大腸腺癌患者獨(dú)立預(yù)后因子參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展。miR-224對(duì)于大腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響的具體機(jī)制尚無報(bào)道，有研究[12]顯示,miRNA能異常調(diào)節(jié)腫瘤增殖，與調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化和組蛋白修飾有關(guān)。同源異型盒基因(Hox)的異常表達(dá)對(duì)于致癌基因和腫瘤抑制因子有重要作用。miR-28-5p在結(jié)腸癌中調(diào)控HoxB3表達(dá)[13]。HoxB3在大腸癌HCT116、RKO、SW480細(xì)胞中表達(dá)異常[14]。HoxB3是Hox家族中的一種，能夠在某些癌癥中影響癌基因啟動(dòng)子通路和腫瘤代謝。

與miR-224 NC組比較, ??P<0.01。圖9 miR-224 inhibitor對(duì)HCT 116細(xì)胞中p21及p27表達(dá)量的影響

與腫瘤相關(guān)的miRNA可通過調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化和組蛋白修飾從而改變表觀遺傳的表型。Hox基因在腫瘤組織中的異常表達(dá)對(duì)于致癌基因和腫瘤抑制因子有重要作用。Ferrando等[15]發(fā)現(xiàn)Hox基因及其輔助因子導(dǎo)致了白血病的發(fā)生,Care等[16]發(fā)現(xiàn)Hox基因通過促血管生成導(dǎo)致了乳腺癌的發(fā)生。Hox家族基因最初是由Mcginnis等在果蠅染色體中發(fā)現(xiàn)的，后相繼在鼠和人類等哺乳動(dòng)物染色體中發(fā)現(xiàn)。Hox基因是一段高度保守的DNA序列，約有183 bp,并含有61個(gè)氨基酸組成的同源域。同源域含有一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋的構(gòu)型，能特異性地識(shí)別以5′-TAAT-3′為核心的DNA序列，進(jìn)而結(jié)合DNA,最終調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[17]。Hox基因家族含有39個(gè)基因，分為4簇，分別為HoxA、HoxB、HoxC和HoxD。HoxB3屬于HoxB簇，對(duì)其研究報(bào)道較少，但已有研究[18-19]證實(shí)HoxB3在乳腺癌、裸鼠多發(fā)性骨髓、急性白血病、乳腺癌、卵巢癌中表達(dá)異常，并與其預(yù)后不良密切相關(guān)。HoxB3在大腸癌HCT116、RKO、SW480細(xì)胞中表達(dá)異常[13]。在前列腺癌組織中HoxB3蛋白及mRNA高表達(dá)，當(dāng)下調(diào)前列腺癌PC-3細(xì)胞中HoxB3的表達(dá)，能顯著抑制體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的增殖[20]。miR-10a通過靶向調(diào)節(jié)HoxB1和HoxB3的表達(dá)，從而調(diào)控胰腺癌的生物學(xué)行為[21]。提示HoxB3與癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)，并可作為miRNA靶蛋白，影響腫瘤細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為。

本研究結(jié)果證實(shí),miR-224在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)高于人正常結(jié)腸直腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC中的表達(dá)，在大腸癌中發(fā)揮類似癌基因的作用，與上述報(bào)道結(jié)果一致。通過MTT法及Annexin v-PI實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-224表達(dá)水平后能顯著抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)HoxB3是miR-224下游靶基因,Western blot及RT-PCR結(jié)果證實(shí)，下調(diào)miR-244的表達(dá)水平后HoxB3蛋白及mRNA表達(dá)量都顯著下降，提示miR-224可能通過靶向HoxB3 mRNA而影響大腸癌細(xì)胞的增殖凋亡等生物學(xué)行為，但是miR-224的靶基因可能有多個(gè)，如miR-224在肝癌中顯著性上調(diào)表達(dá)，通過降低凋亡抑制因子-5(API-5)參與細(xì)胞凋亡[22]。在卵巢癌中,miR-224通過靶作用上皮細(xì)胞特異性蛋白1(KLK10)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，此作用呈劑量依賴性[23]。本研究通過干擾大腸癌細(xì)胞中HoxB3的表達(dá)來模擬大腸癌細(xì)胞中miR-224表達(dá)量的下調(diào)，結(jié)果顯示通過下調(diào)HoxB3表達(dá)水平能顯著抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，從而反向驗(yàn)證了miR-224是通過靶向HoxB3的表達(dá)而干擾大腸癌細(xì)胞的增殖凋亡。

Olaru等[24]報(bào)道m(xù)iR-224在炎性腸病(IBD)中通過調(diào)節(jié)G1-S檢測點(diǎn)及負(fù)調(diào)控p21表達(dá)參與IBD的致癌作用。G1期處于增殖細(xì)胞唯一能夠接受外界增殖與增殖抑制信號(hào)的時(shí)期，是細(xì)胞能否進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)鍵點(diǎn)。其中CyclinD1是G1期關(guān)鍵蛋白，最先在G1期被合成，在G0/G1期到S期的進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞分裂周期相關(guān)的3(CDCA3)、部分的SKP1的cullin-F-box(SCF)泛素連接酶，指的是一個(gè)觸發(fā)進(jìn)入有絲分裂和有絲分裂抑制激酶介導(dǎo)的破壞。p21和p27是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，能分別抑制CyclinD1與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(CDK4)結(jié)合,CyclinE-CDK2結(jié)合，使細(xì)胞不能通過G1期。本研究在此基礎(chǔ)上繼續(xù)探討miR-224表達(dá)水平下調(diào)后對(duì)于大腸癌細(xì)胞增殖，凋亡干預(yù)作用機(jī)制，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224 inhibitor能使大腸癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，同時(shí)經(jīng)Western blot發(fā)現(xiàn),CDCA3、CyclinD1表達(dá)量下調(diào),p21及p27表達(dá)量上調(diào)。說明miR-224能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1。Chen等[20]通過芯片ChIP技術(shù)發(fā)現(xiàn),HoxB3能結(jié)合于CDCA3啟動(dòng)子區(qū)域，反式激活CDCA表達(dá)。Uchida等[25]證實(shí)CDCA3在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中過表達(dá)，用shRNA干擾OSCC細(xì)胞中CDCA3的表達(dá)后，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，并上調(diào)p21及p27等蛋白的表達(dá)，提示miR-224對(duì)大腸癌細(xì)胞周期的阻滯作用機(jī)制可能是通過靶向HoxB3實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,miR-224在大腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，并能通過調(diào)控靶基因HoxB3的表達(dá)參與大腸癌細(xì)胞的增殖與凋亡，且此過程與下調(diào)CDCA3及CyclinD1表達(dá)，上調(diào)p21及p27表達(dá)，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期有關(guān)。