李 冰 駱倩倩 劉同慎

(濱州醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)管理中心, 煙臺 264003)

疏松結(jié)締組織的觀察是組織學(xué)實驗教學(xué)的重要內(nèi)容之一,而實驗中使用的鋪片存在厚薄不均、有皺褶、染色易褪色等影響觀察效果的問題,并且實驗動物腸系膜利用率不高?，F(xiàn)探討了一種既能夠保證質(zhì)量,又能夠一次性大批量制作鋪片的方法,在組織學(xué)實驗教學(xué)中具有廣泛的推廣和應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 腸系膜擴展器的準備

選擇1條12號或者13號(直徑約0.25cm)鐵絲(或者銅絲),長度100～110cm,要求平滑、無彎曲。首先對鐵絲兩端做圓滑處理,再在一端緊套一段軟橡膠空心管,要求鐵絲不得從管另一端穿出。將鐵絲彎曲制作成螺旋彈簧(外徑7～9cm、節(jié)距約0.5cm、總?cè)?shù)約4圈),作為腸系膜擴展器(圖1)。

1.2 實驗動物的處理和腸系膜的取材

Wistar大鼠2只,體質(zhì)量250～300g,雌雄不限。腹腔注射新配制的0.5%的臺盼藍生理鹽水液每只3ml(1次/2天),共注射2次,于第2次注射后的第4天取材。1%的水合氯醛水溶液(150mg/kg)腹腔注射麻醉,頸總動脈放血處死。沿腹正中線打開腹腔,于十二指腸起始部和回腸末端分別剪斷腸管,再剪斷腸系膜根部(注意保持系膜根完整),將腸系膜和與其相連的腸管取下,放入培養(yǎng)皿中。生理鹽水沖洗血液和污物多次。

1.3 腸系膜的鋪展

使用腸系膜擴展器進行： 選擇腸系膜相連腸管的任一斷端,將擴展器的一端穿入腸腔,并小心沿腸管前行,逐漸將腸管全部套在擴展器的鐵絲上(圖2)。沿擴展器慢慢伸展腸管,并根據(jù)腸系膜的大小適當調(diào)節(jié)鋪展器外徑,將腸系膜整體展平(圖4)。注意避免操作過程鐵絲穿透腸壁和損傷腸系膜。

1.4 固定和染色

腸系膜固定和染色的全過程是將擴展器放入常規(guī)染色缸中進行(圖3)。(1) Bouin氏固定液固定12～24h;(2) 75%乙醇浸洗30min(中間換液2次);(3) Weigert彈性纖維染色1h[1];(4) 蒸餾水速洗;(5) Harris蘇木精染細胞核10min;(6) 0.5%鹽酸乙醇(75%乙醇配制)分色;(7) 1%中性紅(50%乙醇配制)染肥大細胞10min;(8) 蒸餾水速洗;(9) 1%焰紅水溶液染膠原纖維和細胞質(zhì)5min;(10) 蒸餾水速洗;(11) 95%乙醇、100%乙醇常規(guī)脫水,二甲苯透明。

1.5 浸膠、剪片和封片

(1) 將擴展器連同腸系膜浸入二甲苯稀釋的中性樹膠液(10%)中,5min取出,通風廚內(nèi)自然干燥;(2) 沿腸管將腸系膜完整剪下,再剪切成大小適宜(約0.3cm×0.3cm)的小片,平鋪在載玻片上,滴加中性樹膠,蓋上蓋玻片封固。

2 結(jié)果

肉眼可見,擴展完成后的腸系膜是以系膜根為中心,沿擴展器向周圍呈螺旋狀伸展,長度約3圈;系膜平展透明,無皺褶,無破損(圖4)。低倍鏡下,腸系膜透明,纖維和細胞分散、分布均勻(圖5)。高倍鏡下,彈性纖維纖細,有分支,呈藍色;膠原纖維粗細不等,但較彈性纖維粗,呈紅色;2種纖維相互交織成網(wǎng)狀(圖6)?？梢娋奘杉毎头蚀蠹毎|(zhì)內(nèi)的顆粒具有顯著差別： 巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)含有大小不一、分布不均、呈藍色的臺盼藍吞噬顆粒;而肥大細胞胞質(zhì)內(nèi)含有的顆粒,大小一致,分布均勻,呈紅色(圖6)。成纖維細胞呈三角形或者多邊形,界限清楚,有突起,細胞核呈藍色,細胞質(zhì)呈紅色,部分細胞的胞質(zhì)中可見少量臺盼藍顆粒(圖6)。

3 討論

小腸系膜即腸系膜是由2層間皮及其之間的疏松結(jié)締組織構(gòu)成,間皮菲薄,結(jié)締組織平展,是制作疏松結(jié)締組織鋪片的良好材料。組織學(xué)實驗教學(xué)中,觀察疏松結(jié)締組織使用的方法有撕片和鋪片[2-3]。撕片是剪取動物的皮下結(jié)締組織,在載玻片上用針將其撕開平攤制作而成,因此,對于疏松結(jié)締組織成分的分布及其排列次序改變較大。而鋪片,只是在疏松結(jié)締組織原有分布狀態(tài)下做了適當?shù)纳煺?故更適合于實驗教學(xué)的使用。但是,將腸系膜鋪平且厚薄均勻是鋪片制作的關(guān)鍵。為此,曾有不少學(xué)者對于腸系膜疏松結(jié)締組織鋪片的制作方法,進行過探索,比如利用電膠木圈固定膜組織[4],或者使用蠟盤借助大頭針固定腸管來展平腸系膜[3]等。雖取得較為滿意的效果,但這些方法只是剪取部分腸系膜進行鋪片,材料的利用率較低,最終制作鋪片的量自然會較少。筆者首次發(fā)明和使用了腸系膜擴展器,可將腸系膜擴展制作成全系膜的整體鋪片。既方便了后續(xù)的固定及其染色操作,也使得能夠利用的腸系膜面積增加2～3倍。經(jīng)過剪切,可以制作出大量的教學(xué)鋪片,顯著提高工作效率及腸系膜的有效利用率。而且,擴展器牽引腸管擴展腸系膜力量均勻,故鋪片更加平展均勻,且無組織結(jié)構(gòu)的破壞。

圖1 腸系膜擴展器.圖2 小腸腸管全部套入系膜擴展器.圖3 常規(guī)染色缸中固定.圖4 沿腸系膜擴展器展平并固定后的腸系膜.圖5 低倍鏡下腸系膜,×100.圖6 高倍鏡下腸系膜,×400?！鳎?膠原纖維;↑： 彈性纖維;←： 成纖維細胞;↓： 肥大細胞;→： 巨噬細胞.

疏松結(jié)締組織鋪片的染色方法采用多種染料組合的復(fù)合染色,筆者在實踐過程中觀察,大多數(shù)方法的重復(fù)性較差,鋪片易出現(xiàn)部分褪色現(xiàn)象,為此本實驗方法在染色方法上也進行了有益的探討。Weigert染料特異性結(jié)合彈性纖維較為緊密,著色后水溶相或者脂溶相較難去除,只是酸乙醇有部分褪色作用,因此筆者首先進行彈性纖維和細胞核染色,再進行一次酸乙醇分色。但膠原纖維較難著色或者著色后很容易褪色,因此,把膠原纖維的染色放到最后進行,并且選用焰紅將膠原纖維染為紅色,來增加與彈性纖維的對比性。對于肥大細胞染色,本實驗使用了中性紅,以期使其胞質(zhì)顆粒的著色與巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)的臺盼藍吞噬顆粒有明顯的對比。染料的選擇以及實驗步驟的安排,經(jīng)過實驗證明,達到了預(yù)期的效果,并且重復(fù)性較好,鋪片可以長久保存。

腸系膜經(jīng)過延展后,雖然經(jīng)過固定、染色、脫水和透明多步驟處理,但是仍然比較柔軟,不方便剪片和封片,并且在封片過程中容易產(chǎn)生皺褶。為此,本方法在剪切之前對腸系膜增加了“浸膠工藝”。即將中性樹膠浸入腸系膜,干燥后使系膜的硬度增加,后續(xù)的剪片和封片操作更為方便。封片后較少產(chǎn)生皺褶,顯著提高鋪片的質(zhì)量。

實踐證明,利用彈簧式擴展器制作的腸系膜鋪片,在質(zhì)量和數(shù)量上均有顯著提高,在應(yīng)用過程中應(yīng)該特別注意以下問題： (1) 制造擴展器材料的粗細和硬度應(yīng)適當,細軟材料在后期系膜干燥后,擴展器容易變形引起系膜皺縮,粗硬材料制造的擴展器,其直徑不易調(diào)節(jié);(2) 腸管伸展均勻,才能夠使腸系膜平展、厚薄均勻,故擴展器穿腸套管時,需要小心仔細,避免刺破腸壁發(fā)生某個方向牽引力的改變,導(dǎo)致腸系膜皺縮;(3) 腸系膜擴展定位后,可以用細線結(jié)扎固定腸管兩端,防止腸管回縮;(4) 腸系膜在擴展器上擴展完成后,使用生理鹽水再次清潔,并借用軟毛筆刷洗去除滲出到其表面的少量炎性細胞和表面吸附的胎盤藍染料;(5) 固定液的固定時間要足夠,以保證腸系膜固定良好的同時,也使腸管得到硬化,防止腸管回縮引起的系膜皺縮。