孫丹華 陳旭東 徐紀偉

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 漯河 462002)

脊髓損傷后神經(jīng)功能難以恢復(fù),這是因為神經(jīng)細胞再生修復(fù)能力較弱以及損傷區(qū)域出現(xiàn)大量炎癥介質(zhì)、過氧化物、鈣離子及神經(jīng)生長抑制因子[1],神經(jīng)細胞受到毒性損傷,因此改善脊髓內(nèi)微環(huán)境,減少炎癥因子,才能激活內(nèi)源性再生系統(tǒng),有利于神經(jīng)功能恢復(fù)[2]。蛹蟲草是我國傳統(tǒng)珍貴中藥材,它性甘、溫平、無毒,具有抗炎、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等藥理作用,它的有效活性成分是蟲草素即3′-脫氧腺苷[3-4]。本研究采取蟲草素治療脊髓半橫切損傷,用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡觀察突觸分化誘導(dǎo)基因1(synapse differentiation induced gene 1, SynDIG1)表達,用BBB評估體系和斜板試驗評價肢體運動情況,探討神經(jīng)損傷修復(fù)的內(nèi)在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

選取200～220g SD雌性大鼠240只(中原正大實驗動物中心,合格證： SCXK豫2010-0002)。

蟲草素購自于美國Sigma公司;小鼠抗大鼠SynDIG1抗體購自密理博公司;FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、生物素化山羊抗小鼠IgG、ABC試劑均購自中杉生物公司;Leica CM1850恒冷箱冰凍切片機購自Leica儀器有限公司;熒光顯微鏡購自中國奧卡光學(xué)儀器有限公司。

1.2 動物模型

動物隨機分成對照組、損傷組、低劑量和高劑量治療組。脊髓損傷模型,用戊巴妥鈉麻醉大鼠,將其四肢固定于實驗臺上,剪除皮毛消毒,切開后背正中皮膚,分離皮下組織和肌肉,咬除第9、10胸椎棘突及椎板,露出脊髓組織,快速切斷一側(cè)脊髓,縫合傷口,注射抗生素。

低、高劑量治療組分別給予腹腔注射蟲草素5mg/kg、12.5mg/kg,1周后停藥,損傷組用0.9%NaCl代替蟲草素,對照組僅給予抗感染治療。

1.3 取材和切片

術(shù)后14、21、28、35d,每組每時點選5只動物。用戊巴妥鈉麻醉大鼠,打開胸腔露出心,將針頭插入左心室至升主動脈,切開右心房,注入0.9%NaCl 250ml,待流出液體清亮注入4%多聚甲醛300ml,咬除棘突和椎板,暴露脊髓組織,取損傷區(qū)脊髓組織,行OCT包埋切片。

1.4 免疫熒光染色

切片滴加SynDIG1抗體,4℃過夜,PBS洗3次,每次5min,再滴加FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,4℃孵育12h,PBS洗3次,每次5min,甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察。陰性對照不加一抗,只加二抗。鏡下觀察到綠色神經(jīng)細胞即為SynDIG1陽性細胞,每只動物取5張切片計數(shù)陽性細胞總數(shù),取每個時點平均值。

1.5 行為學(xué)評價方法

1.5.1 斜板試驗 將各組大鼠置于一塊平坦但不光滑的斜板上,斜板由零度緩慢上升,每次升高5°,至大鼠停留原有位置而不跌落5s時讀取斜板度數(shù),每只大鼠重復(fù)3次取平均值。

1.5.2 BBB運動評分 將動物放入帶條紋的地板,輕敲盆壁使其爬行。觀察臀、膝、踝的運動,觀察腳掌負重站立和軀干協(xié)調(diào)運動情況,觀察后腳爪伸展著地和尾巴的平衡情況。

1.6 免疫印跡

術(shù)后5個時間點每組取5只動物取材,取損傷區(qū)脊髓組織并研磨,冰上靜置1h,低溫高速離心15min,吸取上清待用,用SDS-PAGE不連續(xù)緩沖系統(tǒng)電泳,將PVDF膜放入TBST(含50g/L脫脂奶粉)封閉2h,TBS洗3次,每次5min;滴加SynDIG1抗體(1∶500),4℃過夜,TBS洗3次,每次5min,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(1∶500),放置2h,TBS洗3次,每5min,加ABC試劑,DAB顯色,測目的條帶與β-actin條帶的吸光度值比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蟲草素治療明顯增加損傷脊髓的SynDIG1表達

術(shù)后第14天,高、低劑量治療組和損傷組脊髓內(nèi)均有SynDIG1陽性神經(jīng)細胞,在28d達到高峰,之后呈高水平表達,且SynDIG1陽性神經(jīng)細胞數(shù)量高劑量治療組明顯高于低劑量治療組,低劑量治療組明顯高于損傷組,而對照組則無SynDIG1陽性神經(jīng)細胞(圖1,表1)。

圖1 脊髓損傷后28d各組SynDIG1表達,免疫熒光染色,×200,標(biāo)尺=50μm

表1 脊髓損傷后各時間點SynDIG1陽性神經(jīng)元數(shù)量

*P<0.05vsinjury group;△P<0.05vslow dose treatment group;#P<0.05vshigh dose treatment group

2.2 蟲草素增加損傷脊髓的SynDIG1的含量

術(shù)后第14天,高、低劑量治療組和損傷組的脊髓內(nèi)出現(xiàn)SynDIG1表達,且呈現(xiàn)逐漸升高趨勢,一直到損傷后第28天達到峰值,之后一直維持在較高水平;并且SynDIG1表達水平高劑量治療組明顯高于低劑量治療組,低劑量治療組明顯高于損傷組,對照組則未見SynDIG1表達(圖2)。

2.3 蟲草素改善脊髓損傷大鼠的BBB評分

所有動物術(shù)前評分為21分,在術(shù)后14d對照組評分達到20分,功能基本恢復(fù)正常。高、低劑量治療組和損傷組BBB評分呈現(xiàn)逐漸升高趨勢,且術(shù)后各時間點高劑量治療組BBB運動功能評分明顯高于低劑量治療組和損傷組,低劑量治療組BBB運動功能評分明顯高于損傷組(表2)。

2.4 蟲草素提高脊髓損傷大鼠斜板試驗評分

術(shù)前動物斜板試驗角度達70°～75°,術(shù)后斜板試驗角度至20°,表明模型制作成功。高、低劑量治療組和損傷組斜板試驗角度呈現(xiàn)逐漸增大趨勢,且術(shù)后各時間點高劑量治療組斜板試驗角度明顯大于低劑量治療組和損傷組,低劑量治療組斜板試驗角度明顯大于損傷組(表3)。

圖2 免疫印跡檢測各組脊髓SynDIG1的表達

表2 術(shù)后各組BBB評分比較 分)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsinjury group;#P<0.05vslow dose treatment group

表3 術(shù)后各組斜板試驗比較

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsinjury group;#P< 0.05vslow dose treatment group

3 討論

脊髓損傷后由于機械性破壞組織結(jié)構(gòu)導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷和凋亡,同時由于大量的炎癥因子和自由基釋放、鈣離子內(nèi)流失衡、調(diào)亡基因大量表達,這些因素將會引起細胞周期停滯,損傷DNA,引發(fā)細胞凋亡,特別是炎癥因子會促使神經(jīng)突觸囊泡內(nèi)的谷氨酸大量釋放,使神經(jīng)細胞受到谷氨酸興奮性毒性損傷,進一步加重神經(jīng)損傷[9]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腺苷具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)突觸可塑性、缺血性神經(jīng)保護等作用。腺苷是通過4個亞型受體(A1、A2A、A2B和A3)發(fā)揮藥理活性,其中A1受體可以調(diào)節(jié)突觸傳導(dǎo)和神經(jīng)元超極化,A2A受體調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放,A2B受體調(diào)節(jié)cAMP水平和鈣離子通道,A3受體調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性[10]。蟲草素是3′-脫氧腺苷,屬于一種腺苷的衍生物,藥物動力學(xué)顯示腺苷衍生物是通過腺苷轉(zhuǎn)運體經(jīng)血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),它可以激活A(yù)1、A2A和A3受體,調(diào)節(jié)活性氧和鈣離子信號通路,減少由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的半脫天冬氨酸蛋白酶12高表達,抑制神經(jīng)細胞死亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11]。此外，蟲草素還可以激活T淋巴細胞,促進單核細胞分泌IL-10,從而降低TNF-α和IL-1b 表達水平,發(fā)揮抗炎癥作用[12];蟲草素還可逆轉(zhuǎn)由脂多糖誘導(dǎo)NF-kB表達和抑制Akt與p38磷酸化,減少NOS1、NOS2轉(zhuǎn)錄表達,清除內(nèi)源性NO,減輕海馬神經(jīng)氧化應(yīng)激神經(jīng)損傷,促進生長錐發(fā)育和樹突棘形成[13-15];蟲草素還能降低腦組織內(nèi)谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽水平,減少丙二醛的含量,激活超氧化物歧化酶,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16-17];蟲草素還可以清除活性氧自由基,抑制小膠質(zhì)細胞激活,對神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用[18]。蟲草素的抗炎、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)作用,有利于改善神經(jīng)損傷區(qū)域微環(huán)境,促進神經(jīng)系統(tǒng)運動功能恢復(fù)。

SynDIG1是最新發(fā)現(xiàn)與突觸分化、發(fā)育密切相關(guān)的跨膜蛋白,具有介導(dǎo)神經(jīng)快速興奮性突觸傳遞作用,參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶活動特性的調(diào)節(jié)蛋白,通過改變神經(jīng)細胞SynDIG1表達水平顯示興奮性突觸在數(shù)量和功能等方面出現(xiàn)顯著變化。目前研究表明SynDIG1興奮性突觸傳遞與AMPAR有密切關(guān)系,當(dāng)SynDIG1過表達時AMPA含量也隨之增加,當(dāng)敲除SynDIG1基因時AMPA含量也隨之降低。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)AMPA受體主要分布在突觸后膜上,它包含GluR1～GluR4 4個亞基,每個亞基由N端1個、跨膜區(qū)域3個、有孔發(fā)夾結(jié)構(gòu)1個和C端1個構(gòu)成[19],其中GluR1磷酸化水平與突觸遷移和膜定位密切相關(guān),在突觸位點GluR1變化水平與LTP和LTD相關(guān),即GluR1磷酸化水平越高,突觸位點的LTP越強[20]。研究表明神經(jīng)細胞經(jīng)蟲草素預(yù)處理后,可顯著提升GluR1在小鼠前額葉皮層和海馬體突觸表達水平,但是GluR2表達水平則沒有發(fā)生明顯變化。蟲草素可以通過特異AMPA受體亞基GluR1/3調(diào)控突觸傳導(dǎo),GluR1 Ser845是一個蛋白激酶A位點,該位點磷酸化激活神經(jīng)細胞內(nèi)AMPA受體,增加受體在神經(jīng)細胞膜嵌入,促進LTP的發(fā)生,且蟲草素劑量越高、磷酸化作用越強、AMPA受體含量越多,且可發(fā)生反饋性作用,進而調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性[21-23]。

免疫熒光、免疫印跡研究結(jié)果顯示脊髓損傷后用蟲草素可以促使神經(jīng)細胞內(nèi)SynDIG1大量表達,減少組織囊性空腔和減輕炎癥細胞浸潤情況。這是因為蟲草素不僅可以清除過氧化物酶、激活超氧化物歧化酶、減輕鈣超載、促使免疫細胞分泌抗炎因子,抑制細胞凋亡,而且它還可以促使GluR1磷酸化,提升GluR1表達水平,激活A(yù)MPA受體,從而反饋性促進SynDIG1大量表達,調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸分化、發(fā)育及興奮性傳遞作用,最終改善神經(jīng)損傷區(qū)域微環(huán)境、有利于神經(jīng)再生。

行為學(xué)實驗結(jié)果表明,蟲草素治療脊髓損傷能有效促進動物的肢體運動功能恢復(fù),并且在術(shù)后第14天動物的運動功能評分就已明顯高于損傷組,神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)良好。蟲草素對脊髓內(nèi)SynDIG1表達的影響與其對運動功能恢復(fù)的影響表現(xiàn)出趨勢一致,這個現(xiàn)象也從側(cè)面說明脊髓內(nèi)微環(huán)境得到了極大的改善,啟動了內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)系統(tǒng),但具體機制尚待進一步研究。

綜上所述,蟲草素明顯改善損傷區(qū)域的微環(huán)境,激活神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性修復(fù)機制,促進神經(jīng)細胞SynDIG1大量表達,有利于神經(jīng)再生及神經(jīng)系統(tǒng)運動功能恢復(fù)。