任 敏 徐 冉 梁娟娟 張 方 晏 鵬 張盛周 吳孝兵

(安徽師范大學生命科學學院保護生物學教研室, 蕪湖 241000)

ZENK基因,又稱Zif268、Egr-1、NGFI-A、Krox-24(22-25)、ZNF225等[1],屬于即刻早基因家族,是一種由3個鋅指結(jié)構組成的鋅指轉(zhuǎn)錄因子[2],其結(jié)構在黑猩猩、鼠、牛、鳥類和斑馬魚等多個物種中十分保守[3]。有關ZENK基因的研究主要集中在聽覺誘導和聲音刺激上。ZENK基因可以由環(huán)境刺激誘導而迅速表達[3],鳴禽鳴唱或聽到另一同種個體鳴唱時,與發(fā)聲交流相關的端腦中ZENK mRNA水平會迅速上升，用來識別和處理同種聽覺信號[1]。ZENK基因的表達還與個體認知學習和記憶有關。鳴禽聽到同種鳴曲重放時,腦中會迅速誘導ZENK基因的表達,同種鳴曲誘導ZENK基因表達最為顯著,其次是異種鳴曲,而在純音誘導下未發(fā)現(xiàn)ZENK基因的表達[1,4]。反復播放同一鳴曲后ZENK基因表達減少,但重新播放另一同種鳴曲仍能再次誘導ZENK基因的高表達[5]。

目前對于ZENK基因的研究主要集中在哺乳類和鳥類,而兩棲類和爬行類的研究則較少。牛蛙是生物學實驗中常用的實驗動物,是良好的實驗材料。本研究以美洲牛蛙(Rana catesbeiana)腦為研究對象,利用免疫組織化學研究ZENK蛋白在牛蛙腦中的分布與定位,可為進一步研究其在兩棲類中的生理功能積累材料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與組織處理

健康的成年美洲牛蛙(以下簡稱“牛蛙”)雌、雄共12只(夏季和冬季雌、雄蛙各3只),分別于2017年1月(冬季)和8月(夏季)購于安徽省蕪湖市農(nóng)貿(mào)市場。牛蛙經(jīng)乙醚麻醉后,取出全腦(包括大腦、間腦、中腦、小腦和延腦),立即用4%多聚甲醛固定48h。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋。

1.2 組織切片和免疫組織化學顯色

常規(guī)組織學切片,冠狀連續(xù)切片,厚度為5μm,從每5個連續(xù)切片中選取1個切片用于免疫組織化學顯色。組織切片經(jīng)脫蠟和復水后,采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)法進行顯色(濃縮型SABC-POD試劑盒,SA2001,購于武漢博士德),方法如下： 用3%的H2O2孵育30min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS緩沖液沖洗2次后,用山羊血清封閉液孵育30min以阻斷非特異性反應,滴加一抗(ZENK單克隆抗體,ab55160,購于Abcam公司,稀釋倍數(shù)為1∶100)4℃過夜。滴加二抗、三抗后,用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒(PA110,購于北京天根)顯色10min,蘇木精復染30s便于陽性反應的觀察(用于光密度分析的切片則不作復染),脫水透明封片。每次實驗均設置陰性對照,用PBS代替一抗,其余步驟同上。最后在Olympus BX 61顯微鏡下觀察、記錄、攝片。

1.3 光密度分析

利用Image-Pro Plus 6.0軟件,對放大400倍的組織切片陽性部位進行光密度定量分析,測出陽性部位的面積和累積光密度,并計算出平均光密度(mean density, MD)。陽性反應越強烈,陽性部位的染色越深,其MD值越大。

1.4 統(tǒng)計學處理

以MD值的大小表示陽性反應的強弱,用SPSS軟件進行t檢驗,比較ZENK蛋白在不同性別牛蛙腦中分布的差異顯著性,當P<0.05或P<0.01時,為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

牛蛙屬于無尾兩棲類,其腦部結(jié)構較簡單,包括大腦、間腦、中腦、小腦、延髓5個部分(圖1)。在光鏡下,可見明顯的免疫組織化學棕黃色的陽性反應,經(jīng)顯微拍照和光密度分析后,牛蛙腦內(nèi)ZENK蛋白的分布見表1。

圖1 牛蛙腦部結(jié)構示意圖

表1 ZENK蛋白在牛蛙腦中的分布

(續(xù)表1)

*P<0.05,**P<0.01vsfemale. Dc： dorsal cortex; Sep： septum; Str： striatum; Ph： primordial hippocampus; Ppa： primordial piriform area; Vtn： ventromedial thalamic nucleus; Pa： preoptic area; Hy： hypothalamus; Tec： tectum; Teg： tegmentum; Pg： pretectal gray; Natg： nucleus anterodorsalis tegmenti; Natc： nucleus anterovetralis tegmenti; Ml： molecular layer; Gl： granular layer; Pcl： Purkinje’s cellular layer; Ra： raphe nuclei; Rn： reticular nuclei; Stn： solit tract nucleus.

2.1 大腦

大腦由左右兩個側(cè)腦室構成,其結(jié)構相對于哺乳動物較簡單。ZENK蛋白的陽性細胞主要存在于大腦的背側(cè)皮質(zhì)、原始海馬、紋狀體及原始梨狀區(qū)。觀察可見,夏季雌蛙和雄蛙的ZENK蛋白分布略有不同。夏季雌蛙在大腦的背側(cè)皮質(zhì)、紋狀體中陽性細胞較多,染色最深,胞體和突起中均有很強的陽性反應,而夏季雌蛙在這些區(qū)域的陽性反應較弱(P<0.01)。夏季雌、雄蛙在原始海馬和原始梨狀區(qū)的陽性細胞略少,陽性反應較強,僅有胞體著色,少數(shù)細胞突起有較淺染色;在隔區(qū)的陽性反應最弱,染色較淺。冬季雌、雄蛙大腦中均未見陽性細胞(圖2A～E,見封二)。

2.2 間腦

間腦位于大腦和中腦之間。此結(jié)構中,ZENK蛋白的強陽性反應主要出現(xiàn)在夏季雌、雄蛙的視前區(qū)和丘腦腹側(cè)內(nèi)核中,陽性細胞較多,染色較深,胞體和突起均有染色,且夏季雌蛙在視前區(qū)的陽性反應比雄蛙強(P<0.05)。在夏季雌、雄蛙的下丘腦中,陽性細胞較少,染色較淺,僅有細胞胞體著色。在冬季雌、雄蛙中未觀察到明顯的陽性細胞(圖2F～G,見封二)。

2.3 中腦

中腦介于間腦與腦橋之間,背面分左右兩葉,為一對卵圓狀突起,稱為中腦視葉,是兩棲爬行類動物的高級中樞結(jié)構。在夏季雌、雄蛙的中腦中,陽性細胞廣泛存在于各個區(qū)域,陽性反應較強。在視頂蓋及中腦水管附近的一些被蓋核團(包括背、腹前側(cè)被蓋核)中,陽性細胞胞體和突起均有較強的染色,在頂蓋前灰質(zhì)和被蓋中胞體著色的陽性細胞較多,但染色較淺,陽性反應稍弱,僅有少量的細胞突起有陽性反應。此外,夏季雌蛙在背、腹前側(cè)被蓋核中的陽性反應比夏季雄蛙的強(P<0.05)。而冬季雌、雄蛙中腦內(nèi)則未觀察到陽性反應(圖2H～L,見封二)。

2.4 小腦

小腦位于大腦半球后端,覆蓋于延髓與腦橋之上,橫跨于延髓、中腦兩者間,其分化自胚胎初期的菱腦。夏季雌、雄蛙在小腦Purkinje細胞層陽性反應最強,胞體和突起染色均比較深。夏季雌蛙在小腦分子層和顆粒層陽性陽性反應較弱,陽性細胞較少,僅有胞體著色;而夏季雄蛙在分子層和顆粒層的陽性反應均強于夏季雌蛙(P<0.05)。觀察可見冬季雌、雄蛙小腦中沒有明顯的陽性反應(圖2M～N,見封二)。

2.5 延髓

延髓居于腦的最下部,上接腦橋,與脊髓相連。夏季雌、雄蛙延髓的中縫核、網(wǎng)狀核以及孤束核內(nèi)均有染色較深的陽性細胞,但在中縫核中夏季雄蛙的陽性反應強于夏季雌蛙(P<0.05)。中縫核附近的陽性細胞胞體和突起均有較強的陽性反應,而在孤束核和網(wǎng)狀核中,陽性反應主要表現(xiàn)在胞體上,僅有少量突起有陽性反應,且染色較淺。在冬季雌、雄蛙延髓中仍未見有明顯的陽性細胞(圖2O～P,見封二)。

3 討論

ZENK基因通常與神經(jīng)元的活動緊密相關,能準確地反映細胞的活性位置[6],因此成為國內(nèi)外學者研究的熱點。本研究以牛蛙腦為研究材料,首次涉及ZENK蛋白在兩棲類全腦中的分布與定位,對比分析了夏季和冬季雌、雄蛙腦中ZENK蛋白的分布差異。

3.1 牛蛙腦不同區(qū)域內(nèi)的ZENK蛋白分布

鳥類的研究表明,ZENK蛋白在大腦紋狀體中的陽性反應最為顯著[1]。海馬體和紋狀體參與許多與學習記憶高度相關的認知功能[7],因此推測ZENK蛋白在牛蛙原始海馬、紋狀體分布較多與其運動及認知記憶有關。

蛙類的中腦和間腦都是主要的視覺中樞[8]。ZENK蛋白在南美泡蟾[9]和凹耳蛙[10]的中腦被蓋及腦橋上橄欖核中有分布,這與本研究結(jié)果一致。研究表明,視網(wǎng)膜發(fā)出的視神經(jīng)纖維會投射到丘腦、視頂蓋和下丘腦上[11],因此ZENK蛋白在牛蛙丘腦及中腦中的分布可能與其視覺功能相關。

Long和Salbaum[12]利用原位雜交技術觀察到ZENK基因在鳥類小腦顆粒細胞層中的顯著表達。小腦與許多動物行為緊密聯(lián)系,包括行為控制、語言、認知記憶、學習等[13]。因此牛蛙小腦中ZENK蛋白分布可能還參與了其對環(huán)境的認知、記憶及行為協(xié)調(diào)等方面的活動。

3.2 夏季、冬季牛蛙腦中ZENK蛋白分布

據(jù)觀察,冬季牛蛙行動遲緩,而夏季牛蛙活動性較強,對環(huán)境中的刺激比較敏感。冬季蛙類多數(shù)有冬眠的習慣,此時生命活動處于極度降低的狀態(tài),代謝功能和神經(jīng)活動都顯著降低[14]。ZENK蛋白的分布與神經(jīng)元活動密切相關,冬季牛蛙中未觀察到ZENK蛋白陽性表達物可能與此時牛蛙極少的神經(jīng)活動有關。

3.3 雌、雄牛蛙腦中ZENK蛋白分布

血漿中雌二醇的循環(huán)和聽覺端腦中去甲腎上腺素的分泌可介導更強的ZENK蛋白的免疫反應[15]。雌二醇是由卵巢成熟濾泡分泌的一種自然雌激素[16],能作用于聽覺端腦及其受體上,通過去甲腎上腺素能依賴過程影響ZENK基因的表達[17-18],因此雌性牛蛙在大腦和間腦視前區(qū)ZENK蛋白分布較多可能與其腦中雌二醇的分泌有關。中縫核群能夠參與性行為的調(diào)節(jié)[19],夏季雄蛙處于性行為較活躍的繁殖期,研究表明ZENK基因的表達與鳴禽求偶行為的強度成正相關[20],因此雄蛙小腦和延髓中縫核區(qū)ZENK蛋白分布較多可能也與其求偶、交配等繁殖行為有關。

綜上所述,牛蛙腦中ZENK蛋白分布與其他動物有一定的相似性,在腦中參與調(diào)控動物的多種行為。ZENK蛋白在不同季節(jié)牛蛙腦中的分布差異可能與其腦內(nèi)的神經(jīng)活動有關,不同性別牛蛙腦中ZENK的蛋白分布差異可能與其雌二醇分泌及活躍的性行為相適應。但ZENK基因在牛蛙腦中是如何參與認知、運動等行為調(diào)控的,還有待更深入的研究。