胡亞男 郭志剛 李銀生△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院, 1 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 2 形態(tài)學(xué)實驗室, 新鄉(xiāng) 453000)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)可發(fā)生于各年齡階段的人群,在臨床上以起病急、發(fā)展迅猛、死亡率高為特點,早期如不有效控制病情將迅速發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),重癥患者更會演變?yōu)槎嗥鞴俟δ苷系K綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1]。多年的臨床觀察和實驗研究表明,急性肺損傷發(fā)生時,全身炎癥反應(yīng)綜合征[2](systemic inflammatory response syndrome, SIRS)與代償性抗炎介質(zhì)反應(yīng)綜合征(compensated anti-inflammatory response syndrome, CIRS)的平衡會很容易被打破,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)作為2種炎性介質(zhì)也參與其中[3]。本研究探討不同劑量姜黃素對急性肺損傷的保護作用,以及其作用機制是否與炎性介質(zhì)TNF-α和ICAM-1相關(guān),進而更好地為姜黃素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SD大鼠60只,SPF級,雄性,6周齡,體質(zhì)量為140～150g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證編號： SCXK(京)2012-0001。注射用鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會社,生產(chǎn)批號： 740140)。姜黃素(四川金郁金科技有限公司,生產(chǎn)批號： 080302,含量95.6%)。TNF-α試劑盒(BA1403)、ICAM-1試劑盒(BA2189)(博士德生物工程有限公司)。

1.2 模型建立及給藥方法

60只大鼠隨機分為假手術(shù)組,模型組,姜黃素高、中、低劑量組,每組12只。腹腔注射10%水合氯醛(每只3.0ml/kg),麻醉成功后將其固定在操作臺上,消毒切皮逐層剝離暴露頸部氣管,模型組和姜黃素高、中、低劑量組大鼠用注射器抽取0.3ml博來霉素生理鹽水溶液(按5mg/kg比例溶于0.2～0.3ml生理鹽水中),將注射器針尖對準環(huán)狀軟骨間隙刺入氣管回抽見空氣后,左手抬高動物頭端一定角度,右手推動針頭順著氣管后壁緩慢注射,再繼續(xù)注入0.3ml空氣,之后立即豎起動物左右旋轉(zhuǎn)并輕拍大鼠胸背部促使藥物在肺部均勻分布,假手術(shù)組用同樣方法注入等體積生理鹽水。造模24h后開始灌胃給藥,姜黃素高、中、低劑量組給藥劑量分別為200、100、50mg·kg-1·d-1[6],假手術(shù)組和模型組分別給予等體積生理鹽水灌胃,實驗期間大鼠均自由進食和飲水。

1.3 標本采集及觀察指標

實驗期間觀察各組SD大鼠一般狀況,分別在給藥后的第3天和第7天各組隨機放血處死6只,取大鼠右肺中葉3小塊(約1cm×1cm×1cm)和2大塊(約2cm×2cm×2cm),其中3小塊經(jīng)過生理鹽水浸洗、裂解、離心、定量,之后遵照免疫印跡實驗操作步驟執(zhí)行,通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析所獲取的目的條帶(TNF-α、ICAM-1)與對應(yīng)的內(nèi)參照條帶的積分吸光度值的比值;剩余2大塊組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片后,一部分用常規(guī)H-E染色觀察其形態(tài)學(xué)改變,另一部分采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法對肺組織TNF-α和ICAM-1進行IHC染色,操作步驟嚴格遵循試劑盒說明書,之后通過使用高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件HMIAS-2000對染色結(jié)果進行半定量分析,將肺組織各時點切片隨機選取5個不重疊區(qū)域進行拍照(×400),輸入圖像分析軟件測定免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度值(IOD值)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

假手術(shù)組大鼠攝食、飲水及活動均正常;模型組大鼠精神萎靡、毛發(fā)凌亂、不思飲食、活動性差,隨時間延長,病情逐漸加重;姜黃素中劑量組大鼠隨時間延長,精神、攝食、活動情況逐漸好轉(zhuǎn),高、低劑量組大鼠反應(yīng)一直處于不適應(yīng)狀態(tài),但比模型組狀態(tài)好。

2.2 大鼠肺組織H-E染色

假手術(shù)組大鼠第3、7天肺組織結(jié)構(gòu)未見異常;模型組大鼠第3天間質(zhì)充血水腫、肺泡腔有炎性滲出,部分肺泡間隔增寬,第7天損傷明顯加重,肺泡腔內(nèi)炎細胞浸潤增多,部分組織有增生表現(xiàn);姜黃素高、中、低劑量組損傷肺組織都有不同程度減輕,炎細胞浸潤減少,充血水腫程度減輕,其中以中劑量組效果最顯著(圖1)。

2.3 大鼠肺組織TNF-α及ICAM-1蛋白表達

經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測，各組中TNF-α蛋白均表達,模型組較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05),姜黃素低、高、中劑量組較模型組顯著降低(P<0.05),且呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,中劑量組平均光密度值最低(表1,圖2)。各組中ICAM-1蛋白表達趨勢同TNF-α(表1,圖3)。

經(jīng)免疫印跡檢測，各組中TNF-α蛋白、ICAM-1蛋白均表達,且急性肺損傷7d后表達更強,因此選取損傷后7d作為免疫印跡檢測時間點,結(jié)果顯示：模型組TNF-α較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05),姜黃素低、高、中劑量組較模型組顯著降低(P<0.05),且呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,中劑量組平均光密度值最低(圖4A,表2)。各組中ICAM-1蛋白表達趨勢同TNF-α(圖4B,表2)。

表1 大鼠肺組織中TNF-α、ICAM-1表達的免疫組織化學(xué)顯色檢測結(jié)果

*P<0.05vssham group,△P<0.05vsmodel group

圖1 各組大鼠肺組織H-E染色,×400.圖2 各組大鼠TNF-α免疫組織化學(xué)顯色,×400.圖3 各組大鼠ICAM-1免疫組織化學(xué)顯色,×400.

圖4 免疫印跡檢法測第7天各組大鼠肺組織中TNF-α(A)和ICAM-1(B)的表達水平

表2 急性肺損傷7d后大鼠肺組織中TNF-α和ICAM-1的灰度值比

*P<0.05vssham group，#P<0.05vsmodel group

3 討論

急性肺損傷是由重度感染、創(chuàng)傷和敗血癥等多種內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的以中性粒細胞浸潤為主的嚴重肺內(nèi)炎癥反應(yīng)[4],最終可發(fā)展成ARDS,病情危重且死亡率高[5]。TNF-α作為一種在炎癥早期快速釋放的快反應(yīng)炎癥因子，是介導(dǎo)肺組織內(nèi)中性粒細胞參與肺損傷的分子生物學(xué)基礎(chǔ),在肺部被激活后則發(fā)生“呼吸大爆發(fā)”,消耗大量的氧并且產(chǎn)生過量的氧自由基,TNF-α和ICAM-1在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中都起到非常重要的作用[6]。大量研究證明姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化等功能[7],能夠抑制前炎癥介質(zhì)發(fā)揮的抗炎作用[8],姜黃素不僅具有廣譜的藥理活性,而且毒副作用低,因此在臨床上開發(fā)極具潛力[9]。

本研究結(jié)果表明,與姜黃素組大鼠相比,模型組大鼠的精神狀態(tài)明顯較差;H-E染色鏡下顯示肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯、肺泡腔內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤、肺間隔增寬;通過免疫組織化學(xué)和免疫印跡檢測顯示TNF-α、ICAM-1的表達量均明顯增高,說明姜黃素確實在大鼠肺組織遭受外界刺激時起到了預(yù)防保護作用,其中以中劑量組抑制效果最好,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，應(yīng)用姜黃素可在一定程度上減輕大鼠急性肺損傷時TNF-α、ICAM-1兩種炎性因子的過度表達,進而減輕局部肺組織的炎癥應(yīng)激反應(yīng),為治療和預(yù)防急性肺損傷提供了新的實驗參考數(shù)據(jù),但其明確的保護機制尚需進一步探索。