張國榮 李鐵軍

(1 長春中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室, 長春 130117; 2 松原市長嶺縣衛(wèi)生監(jiān)督所, 松原 131500)

肌腱韌帶損傷愈后常常由瘢痕組織替代,膠原纖維內的膠原原纖維直徑明顯變小,力學性能低下,易發(fā)生重復斷裂[1-2]。肌腱內的膠原纖維主要由Ⅰ型膠原蛋白構成。Ⅴ型膠原蛋白含量很少,但在損傷肌腱中卻持續(xù)高表達52周[3]。有研究顯示,過多的Ⅴ型膠原抑制Ⅰ型膠原的生長自聚[4],所以降低Ⅴ型膠原表達可能有利于促進大直徑膠原原纖維的再生,提高損傷肌腱的修復效果。本課題組前期培養(yǎng)的肌腱細胞中膠原原纖維直徑減小,大小相對均一,與損傷肌腱類似[7]。RNA干擾技術(RNA interference, RNAi)是一種高效、特異阻斷靶mRNA表達而產生相應功能型缺失的新技術[5-6]。肌腱組織中Ⅴ型膠原的分子組成為COL5(α1)2(α2),本研究利用RNAi法干擾大鼠肌腱細胞中COL5α1和COL5α2基因表達,構建成組織工程肌腱進行膠原含量測定與微觀形態(tài)檢測,體外研究降低V型膠原表達對膠原纖維生長自聚的影響,從而探求V型膠原在肌腱損傷修復過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 肌腱細胞培養(yǎng)及組織工程肌腱的構建

取SD大鼠跟腱,按常規(guī)方法培養(yǎng)肌腱細胞,取P5以內的細胞用于后續(xù)實驗。培養(yǎng)大鼠肌腱細胞,定期更換培養(yǎng)基并加入維生素C以促進細胞外基質分泌和防止細胞老化。2周后,沿培養(yǎng)皿邊緣慢慢卷起細胞片,繼續(xù)培養(yǎng)1周,使細胞片光滑面與粗糙面充分融合形成圓柱形的組織工程肌腱[7]。

1.2 損傷肌腱模型的制備

損傷肌腱組織來源于SD大鼠髕韌帶,做1mm×4mm 全層窗口缺損,自然修復1周。對照組為SD大鼠正常髕韌帶組織。

1.3 實時熒光定量PCR檢測相關基因的表達

取大鼠損傷自然修復后的肌腱組織和體外構建的組織工程肌腱,以正常肌腱組織作為對照組。采用-actin為內參,實時熒光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)，RT-PCR法檢測COL5α1、COL5α2和COL1α1基因的表達。

1.4 siRNA轉染大鼠肌腱細胞及分組

由Ambion公司合成干擾COL5α1和COL5α2亞基的siRNA序列[8],用Lipofectamine TM2000轉染處于對數生長期的大鼠肌腱細胞。轉染干擾COL5α1亞基的siRNA為α1siRNA實驗組,轉染干擾COL5α2亞基的siRNA為α2siRNA實驗組,轉染FAM標記的亂序siRNA為對照組。

1.5 RT-PCR法及免疫熒光法檢測肌腱細胞相關基因和蛋白的表達

肌腱細胞轉染特定siRNA 48h后,收集肌腱細胞,提取RNA,采用actin為內參,RT-PCR法定量分析COL5α1、COL5α2和COL1α1基因的表達。肌腱細胞轉染特定siRNA 72h后,免疫熒光法檢測COL5α1和COL5α2在蛋白水平的表達。

1.6 肌腱細胞膠原含量測定

將α1siRNA實驗組、α2siRNA實驗組和對照組培養(yǎng)的肌腱細胞制成組織工程肌腱,用膠原含量測定試劑盒檢測膠原含量。

1.7 透射電鏡檢測肌腱細胞形態(tài)結構

將α1siRNA實驗組、α2siRNA實驗組和對照組培養(yǎng)的肌腱細胞制成組織工程肌腱,制作透射電鏡標本,檢測內部的膠原原纖維形態(tài)結構。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 損傷肌腱與組織工程肌腱中相關基因的表達

損傷肌腱中COL5α1與COL5α2表達均明顯升高。同時,組織工程肌腱中COL5α1與COL5α2表達也明顯升高,尤其COL5α2表達升高顯著(圖1)。在損傷肌腱和組織工程肌腱中COL1α1表達沒有明顯變化。

圖1 損傷肌腱、組織工程肌腱與正常肌腱中COL5α1、COL5α2與COL1α1基因的表達

2.2 轉染siRNA后肌腱細胞相關基因和蛋白的表達

α1siRNA實驗組中COL5α1基因表達被明顯抑制,抑制程度約70%,COL5α2與COL1α1表達沒有明顯改變。α2siRNA實驗組中COL5α2基因表達被明顯抑制,抑制程度約80%,COL5α1表達被抑制約30%,COL1α1表達被抑制約80%(圖2)。

圖2 轉染48h后,COL5α1、COL5α2和COL1α1在基因水平的表達

轉染72h后,免疫熒光法檢測結果顯示，α1siRNA實驗組中COL5α1蛋白表達被明顯抑制(圖3A～3C),α2siRNA實驗組中COL5α2蛋白表達被明顯抑制(圖3D～3F)。

2.3 組織工程肌腱的膠原含量

膠原含量測定結果顯示,α1siRNA實驗組與α2siRNA實驗組中,組織工程肌腱的膠原含量與對照組相比減少約60%(圖4)。

圖4 組織工程肌腱的膠原含量分析

圖6 轉染48h后,COL5α1、COL5α2與COL1α1基因表達的比例分析

圖3 轉染72h后,COL5α1 (A～C)和COL5α2 (D～F)蛋白的表達

圖5 透射電鏡檢測組織工程肌腱,×73000 (A);膠原原纖維直徑直方圖,n≥300 (B)

2.4 組織工程肌腱的膠原纖維微觀結構

透射電鏡結果顯示α1siRNA實驗組膠原原纖維數量減少,直徑變小,輪廓模糊,膠原原纖維形成障礙(圖5)。α2siRNA實驗組膠原原纖維數量減少,直徑變小,但與α1 siRNA實驗組相比,膠原原纖維數量多,直徑略大,輪廓未模糊(圖5),表明COL5α1與COL5α2分別被抑制后,組織工程肌腱中膠原原纖維結構變化不同。

2.5 相關基因表達比例分析

α1siRNA實驗組中,COL5α1被抑制約70%,COL5α2與COL1α1沒有明顯變化,所以COL5α2/COL1α1不變,COL5α1/COL1α1降低。α2siRNA實驗組中,COL5α2被抑制約80%,COL5α1下降約30%,COL1α1下降約80%,所以COL5α2/COL1α1不變,COL5α1/COL1α1反而升高。

3 討論

本實驗培養(yǎng)大鼠肌腱細胞,構建無支架的組織工程肌腱。此組織工程肌腱由小直徑膠原原纖維構成[7],Ⅴ型膠原表達顯著升高,與損傷肌腱類似。利用RNAi法抑制Ⅴ型膠原2個亞基COL5α1和COL5α2的表達。結果表明,siRNA分子通過脂質體轉染大鼠肌腱細胞后,有效抑制了COL5α1和COL5α2在基因和蛋白水平的表達,為體外研究下調肌腱細胞Ⅴ型膠原表達提供了可行的實驗方法。

本研究通過siRNA抑制肌腱細胞中Ⅴ型膠原2個亞基表達,α1siRNA實驗組和α2siRNA實驗組膠原含量均下降約60%,表明抑制Ⅴ型膠原后,膠原纖維合成減少。膠原纖維主要由I型膠原蛋白構成,基因檢測結果顯示,α1siRNA實驗組中COL1α1表達沒有明顯改變,α2siRNA實驗組中COL1α1表達下降約80%。α1siRNA實驗組和α2siRNA實驗組中COL1α1基因表達差異巨大,組織工程肌腱中膠原合成量卻相近,表明膠原纖維合成量不是由COL1α1基因表達水平一個因素決定,還受其他因素影響。

肌腱損傷后的自然修復過程中Ⅴ型膠原表達升高[9-11],Ⅴ型膠原可能是肌腱損傷修復的必需因子,但過高表達會使修復組織中膠原原纖維直徑明顯變小。α1siRNA實驗組中COL5α1/COL1α1下降,可能無法達到Ⅴ型膠原與Ⅰ型膠原比值的最低要求,導致膠原原纖維形成障礙。α2siRNA實驗組中COL5α1/COL1α1升高,這種變化類似于損傷肌腱修復過程,與對照組相比產生更小直徑的膠原原纖維。上述結果表明,COL5α1/COL1α1過高或過低都不利于損傷肌腱修復,只有保持在適當水平才有可能形成大直徑膠原原纖維。α1siRNA實驗組膠原合成量下降可能是因為COL5α1/COL1α1低于最低要求,膠原原纖維形成障礙導致。α2siRNA實驗組膠原合成量下降可能是因為COL1α1表達降低,Ⅰ型膠原蛋白合成不足導致。

總之,本研究利用RNAi法抑制肌腱細胞中Ⅴ型膠原2個亞基表達,檢測相關基因變化；構建組織工程肌腱,檢測膠原含量和微觀形態(tài)結構。結果顯示,COL5α1/COL1α1可能需要保持在適當水平才能使損傷肌腱再生大直徑膠原原纖維,為進一步研究指明了方向。本研究為促進損傷肌腱修復提供了重要的基礎生物學信息和潛在的基因治療手段。