王佳惠 史樹(shù)堂△ 鮑紅圖 鄭立雙 郗 昕

(河北大學(xué), 1 醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)系, 2 附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心, 保定 071000)

臨床上為提高冠心病早期潛在心肌缺血的檢出能力常使用藥物負(fù)荷試驗(yàn)[1]。腺苷作為一種血管擴(kuò)張劑,在國(guó)外已廣泛應(yīng)用于冠心病的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)[2-3]。下肢動(dòng)脈狹窄疾病是臨床上困擾醫(yī)生多年的難題,早發(fā)現(xiàn)早治療是預(yù)防狹窄疾病發(fā)生的第一步[4]。病變初期血管造影時(shí),血管可見(jiàn)度差或未顯示,臨床不能進(jìn)行正確診斷。本研究利用腺苷可與其受體結(jié)合調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮程度來(lái)模擬肢體運(yùn)動(dòng)后血管擴(kuò)張的過(guò)程,通過(guò)模擬股動(dòng)脈狹窄,觀察腺苷對(duì)股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段的微細(xì)血管的影響，從而為動(dòng)脈早期狹窄病變提供一種新的診斷思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,體質(zhì)量(200～250) g。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證編號(hào)1706274,飼養(yǎng)環(huán)境安靜,室溫20℃～28℃,自然照明。

1.2 主要試劑

腺苷(美國(guó)Sigma公司);1%戊巴比妥鈉、Adora2a (A2a)兔多抗 (Proteintech公司);免疫組織化學(xué)試劑盒SP-9001、DAB顯色劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉,將大鼠固定于帶有電熱板的動(dòng)物臺(tái)上,溫度探頭插入肛門內(nèi)約3cm,維持體溫在35℃～37℃。實(shí)驗(yàn)組沿腹股溝韌帶中點(diǎn)至內(nèi)踝切開(kāi)皮膚,分離股動(dòng)靜脈,選取長(zhǎng)度40mm、直徑0.3mm去尖的針灸針與股動(dòng)脈并排放置,然后緊鄰腹股溝韌帶的下方用手術(shù)線結(jié)扎股動(dòng)脈,結(jié)扎完成后抽出針頭,多普勒超聲檢測(cè)結(jié)扎造模后股動(dòng)脈血流,若血流能逐漸恢復(fù)至結(jié)扎前水平,則股動(dòng)脈狹窄造模成功。對(duì)照組僅做股動(dòng)-靜脈分離不結(jié)扎。分離股四頭肌,使其表面沒(méi)有脂肪組織,以便于觀察。隨后用注射泵于尾靜脈持續(xù)注射腺苷(0.66mg·kg-1·min-1)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 光學(xué)微血管造影(optical microangiography, OMAG)觀察 2組大鼠分別在尾靜脈注射腺苷第0、4、8、12分鐘時(shí)用OMAG觀察股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段血流量的變化,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Image J進(jìn)行圖像處理。

1.4.2 雙光子熒光顯微鏡(two-photon excited fluorescence microscopy, 2-photon)觀察 2組大鼠分別在尾靜脈注射腺苷,第0、8分鐘時(shí)用2-photon觀察股四頭肌的毛細(xì)血管數(shù)量的變化,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Imaris進(jìn)行圖像處理。

1.4.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)股四頭肌內(nèi)血管A2a的表達(dá)含量 給藥8min后快速分離出股四頭肌浸入中性福爾馬林中固定24h,石蠟包埋、切片,厚度6μm。常規(guī)免疫組織化學(xué)顯色，高倍鏡下采集視野,取10張切片,每張觀察5個(gè)視野,以陽(yáng)性率平均值作統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段血流量的變化

實(shí)驗(yàn)組股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段血流量在給腺苷后開(kāi)始下降,并在8min時(shí)達(dá)到最小值,8min后血流量開(kāi)始回升(P<0.05);對(duì)照組股動(dòng)脈血流量在給腺苷后并沒(méi)有出現(xiàn)明顯差別(P>0.05)(圖1)。

2.2 大鼠股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段毛細(xì)血管數(shù)量的變化

實(shí)驗(yàn)組給腺苷8min后股四頭肌的毛細(xì)血管數(shù)量明顯低于給藥前(P<0.05);對(duì)照組股四頭肌毛細(xì)血管數(shù)量在給藥前后并沒(méi)有顯著區(qū)別(P>0.05)(圖2)。

2.3 大鼠股動(dòng)脈狹窄部位A2a受體的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組股動(dòng)脈結(jié)扎部位遠(yuǎn)段A2a受體表達(dá)的陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

圖1 股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段血流量的變化。實(shí)驗(yàn)組腺苷注入0min (A)、4min (B)、8min (C)和12min (D)；對(duì)照組(E).圖2 股動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)段毛細(xì)血管數(shù)量。實(shí)驗(yàn)組注入腺苷0min (A)、8min (B)；對(duì)照組(C).圖3 股動(dòng)脈結(jié)扎部位遠(yuǎn)段A2a受體的表達(dá),免疫組織化學(xué)顯色,×200。實(shí)驗(yàn)組(A),對(duì)照組(B).

3 討論

腺苷是體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝的中間產(chǎn)物,其心血管效應(yīng)主要包括擴(kuò)張冠脈血管抑制交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素及對(duì)心的負(fù)性變時(shí)性、變異性的作用[5-6]。同時(shí)腺苷也是一種血管擴(kuò)張劑,可產(chǎn)生“動(dòng)脈竊血”現(xiàn)象,缺血區(qū)與非缺血區(qū)的血流分布差異進(jìn)一步增大,對(duì)比更加明顯[7]。腺苷在體內(nèi)發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過(guò)結(jié)合腺苷受體而產(chǎn)生的。腺苷受體是一種G蛋白偶聯(lián)的受體,分為4種,即A1、A2a、A2b和A3[8]。腺苷與A2a的結(jié)合能活化腺苷環(huán)化酶(AC),增加第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的濃度,激活蛋白激酶A(PKA),進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[9]。另外,腺苷與腺苷受體A2a的結(jié)合還可以調(diào)節(jié)血管的舒張[10]。因此在利用腺苷復(fù)制肢體運(yùn)動(dòng)后肢體血管擴(kuò)張的實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)觀察腺苷A2a受體在血管狹窄與否中表達(dá)的含量可以間接反映血管的舒張情況。

本研究結(jié)果顯示腺苷對(duì)正常血管遠(yuǎn)段的影響較小,而狹窄血管遠(yuǎn)段的微細(xì)血管數(shù)量和血流量在給藥前后均有明顯的差異,腺苷A2a受體在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)也遠(yuǎn)低于對(duì)照組,這與國(guó)外一些作者的研究結(jié)果一致[11]。因此，腺苷負(fù)荷試驗(yàn)可作為動(dòng)脈狹窄診斷的輔助手段。