常志尚 毋亞仙 劉立娜 譚金山 劉 穎 梁 惠

(青島大學, 1 生物醫(yī)學公共支撐平臺, 2 基礎醫(yī)學院2016級醫(yī)學檢驗技術專業(yè), 3 國家重點實驗室培育基地, 4 基礎醫(yī)學院, 5 公共衛(wèi)生學院, 青島 266071)

近年來,隨著人口老齡化及人們生活水平的提高,糖尿病的患病率逐年升高[1]。多項研究證實,腸黏膜屏障功能異常與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。細胞之間連接裝置在維持腸黏膜機械屏障結構和功能完整性方面發(fā)揮重要作用[3],因此,熟悉和掌握細胞間連接裝置形態(tài)學變化及其檢測方法,對了解糖尿病腸黏膜屏障損傷狀況具有重要意義。透射電鏡技術是生物醫(yī)學領域廣泛應用的重要研究手段,但透射電鏡技術對生物樣品切片制樣及超微結構分析都提出了嚴格要求,不同的組織材料需采用不同的制樣條件,若處理不當,可導致實驗結果失真甚至實驗失敗[4]。本研究采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,優(yōu)化制樣條件制備回腸組織超薄切片,采用透射電鏡對腸上皮細胞連接裝置進行超微結構觀察和分析,旨在為糖尿病影響腸黏膜機械屏障結構與功能提供客觀依據(jù),現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

STZ購自北京Solarbio科技有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、戊二醛、四氧化鋨、812環(huán)氧樹脂、甲苯胺藍、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，均為分析純,購自北京國藥集團化學試劑有限公司;高脂飼料(豬油10%、蔗糖20%、蛋黃粉15%、膽固醇1.2%、豬膽鹽0.2%、鼠維持飼料53.6%，均為國產);claudin、occludin、ZO-1一抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 STZ溶液配制

稱取檸檬酸2.1g,加入雙蒸水100ml中配成A液;稱取檸檬酸鈉2.94g，加入雙蒸水100ml中配成B液。A液與B液以1∶1混合,調節(jié)pH至4.2～4.4。稱取1.0g STZ,加入檸檬酸緩沖液至100ml溶解。冰上保存,現(xiàn)用現(xiàn)配,配好的溶液在30min內注射完畢。

1.3 模型建立與分組

雄性Wistar大鼠30只,體質量(180±20) g,購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,動物合格證號為SCXK(魯)20130001。隨機分為2組： 正常對照組和模型組。普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后,禁食不禁水12h,尾靜脈取血檢測空腹血糖,作為該批次動物基礎血糖值。正常對照組繼續(xù)飼喂普通飼料,模型組更換高脂飼料,喂養(yǎng)30d后,模型組大鼠腹腔注射1% STZ溶液,正常對照組注射檸檬酸緩沖液。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后,禁食不禁水12h,再次檢測尾血血糖,血糖值>11.1mmol/L即為建模成功。成模大鼠繼續(xù)飼喂高脂飼料,正常對照組大鼠飼喂普通飼料,持續(xù)4周,并于第4周末禁食不禁水12h,再次檢測尾血血糖。30%烏拉坦麻醉大鼠,剖開腹腔,腹主動脈取血處死大鼠,迅速分離回盲部以上4cm回腸組織,部分用于透射電鏡超微結構觀察,部分用于免疫印跡檢測。

1.4 空腹血糖水平檢測

采集尾血,采用羅氏血糖儀測定各組動物血糖值。

1.5 大鼠腸上皮細胞連接裝置超微結構觀察

采用透射電鏡技術對各組大鼠回腸組織細胞間連接裝置病理形態(tài)學變化進行超微結構觀察。具體步驟如下：

1.5.1 取材 各組隨機留取5只大鼠回腸組織1cm,37℃溫生理鹽水迅速漂洗3次,濾紙拭干,迅速將腸組織置于蠟盤上并滴加4℃預冷的2.5%戊二醛溶液。用鋒利刀片切取1mm×2mm腸壁組織塊2塊,迅速投入預冷的2.5%戊二醛固定液中,4℃保存。

1.5.2 脫水包埋 取戊二醛固定后腸組織樣品,PBS(pH=7.2)漂洗3次,1%四氧化鋨后固定80min,梯度丙酮脫水,812環(huán)氧樹脂包埋,聚合。

1.5.3 半薄切片制備 修整包埋塊并將其置于超薄切片機上,用鉆石刀切出1μm厚度半薄切片,1%甲苯胺藍染色30s,流水沖洗,晾干。

1.5.4 腸組織定位 取半薄切片置顯微鏡下觀察,選擇腸腔內側面、染色清晰、切面完整的區(qū)域作為超薄切片目標區(qū)域,根據(jù)半薄切片圖像提示從樣品塊上選取目標區(qū)域,以目標區(qū)域為中心將樣品斷面修成0.2mm×0.2mm的正方形。

1.5.5 超薄切片制備及染色觀察 將定位后的樣品塊置于超薄切片機上,使用鉆石刀切取超薄切片,切片厚度70nm,刀速1mm/s連續(xù)濕式切片,150目方華膜銅網撈片。醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛染色。使用透射電鏡對各組大鼠腸上皮細胞連接裝置進行觀察拍攝。

1.6 大鼠腸黏膜細胞緊密連接相關蛋白表達水平檢測

采用免疫印跡檢測各組大鼠回腸組織claudin、occludin、ZO-1蛋白表達水平,以β-actin作為內參照,結果經掃描后輸入計算機,并進行圖像分析。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,計量資料采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 血糖水平檢測

注射STZ 1周后,篩選模型組血糖值>11.1mmol/L的大鼠組成新的模型組,其血糖值較正常對照組顯著增高(P<0.05)。持續(xù)喂養(yǎng)4周后,模型組血糖值依然保持在較高水平,與正常對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且血糖值無明顯回落現(xiàn)象(表1)。

表1 各組大鼠血糖水平檢測

*P<0.05vsnormal control group

2.2 腸上皮細胞連接裝置超微結構病理學變化

正常對照組5只(5/5)大鼠回腸組織腸上皮細胞連接裝置形態(tài)結構均正常,無縫隙增寬等異常病理學表現(xiàn)。模型組5只(5/5)大鼠緊密連接與正常對照組比較稍感松弛,電子密度均有所降低;同時,中間連接、縫隙連接等連接裝置出現(xiàn)縫隙明顯增寬現(xiàn)象(圖1)。

2.3 腸黏膜細胞緊密連接相關蛋白表達水平變化

模型組大鼠回腸組織claudin、occludin、ZO-1蛋白表達水平均較正常對照組顯著降低(P<0.05),提示糖尿病大鼠腸黏膜細胞緊密連接相關蛋白表達受到抑制(圖2)。

圖1 各組大鼠腸上皮細胞連接裝置超微結構病理學觀察

3 討論

透射電鏡是以電子束作為“光源”,通過電磁透鏡成像的電子光學儀器,放大倍數(shù)可達幾十萬倍[4]。透射電鏡技術在各種組織超微結構病理學觀察過程中發(fā)揮無可替代的關鍵作用,同時,其組織切片的制作質量對觀察效果也有較大影響[5]。首先,超薄切片技術是透射電鏡技術中最重要、最基本、最常用的技術,由于電子穿透力低,觀察樣品必須制備成超薄切片,通常為70nm左右,其步驟較石蠟切片更復雜、要求更嚴格[6]。其次,透射電鏡切片要求取材部位準確、一致。本研究為避免取材部位不同造成結果差異,統(tǒng)一將取材部位定為回盲部以上4cm回腸組織,從而保證觀察結果更具可比性。第三,由于腸道表面有皺襞、絨毛等結構,必須仔細清洗腸腔表面殘留的腸內容物,否則會影響切片質量,損壞鉆石刀。本研究在取材過程中,對回腸組織采用37℃溫生理鹽水清洗30s,以模擬組織在體環(huán)境,解決了常規(guī)4℃預冷生理鹽水清洗樣品發(fā)生腸道組織遇冷收縮不易清洗干凈的情況。第四,四氧化鋨后固定時間的選擇也是制樣過程中的重要一步。固定時間過長會造成樣品太脆不易切片、固定時間不足會造成切片襯度過低[7]。本研究不斷優(yōu)化實驗條件,顯示回腸組織使用1%鋨酸后固定80min效果最好。第五,由于超薄切片面積小,需要對樣品進行半薄切片精確定位。本研究主要觀察腸上皮細胞連接裝置,在定位過程中選取腸腔內側、染色清晰、切片完整的區(qū)域作為目標區(qū);同時,修塊時腸腔內側游離面外保留了一部分包埋劑,且內側邊緣與切片方向平行或成銳角,避免出現(xiàn)切片厚度不均或斷裂的現(xiàn)象。此外,本研究采用甲苯胺藍對半薄切片染色后定位,與范曉燕等[8]介紹的不染色直接在相差顯微鏡下觀察不同,染色后組織結構更清晰易辯,并且使用普通生物顯微鏡即可觀察,方便了對樣品待觀察部位的精確定位。

圖2 大鼠回腸組織細胞緊密連接相關蛋白表達水平

本研究成功制備糖尿病大鼠回腸組織透射電鏡切片,并對腸上皮細胞連接裝置進行超微結構形態(tài)學觀察,以便直接客觀了解糖尿病大鼠腸黏膜機械屏障功能狀況。細胞連接是細胞之間相互聯(lián)系、發(fā)揮協(xié)同作用的重要超微結構,主要包括緊密連接、中間連接、橋粒、縫隙連接等,其中,緊密連接是腸黏膜上皮細胞間最主要的連接方式,在封閉細胞間隙,維持腸道屏障結構與功能完整性方面發(fā)揮決定性作用;中間連接、橋粒及縫隙連接具有黏合細胞、增強組織機械性、協(xié)調細胞間運動等作用[9]。細胞連接裝置異常增寬,可使腸壁完整性遭到破壞,腸黏膜屏障功能受損,致使腸道內某些有毒物質進入血液循環(huán),對機體組織器官造成損害,導致多種疾病的發(fā)生。

本研究采用透射電鏡技術對腸黏膜細胞連接裝置超微結構進行觀察,獲得了良好的效果。結果證實,糖尿病大鼠腸上皮細胞連接裝置發(fā)生縫隙增寬、電子密度降低等異常病理變化,與相關報道一致[10]。為驗證透射電鏡觀察結果,本研究采用免疫印跡對回腸組織中部分緊密連接相關蛋白進行了檢測。其中,claudin、occludin為跨膜蛋白,是構成緊密連接的主要骨架蛋白,ZO-1為膜周蛋白,它們對維持腸黏膜上皮細胞極性和調節(jié)腸黏膜屏障通透性具有重要作用[11]。結果顯示,糖尿病大鼠回腸組織claudin、occludin及ZO-1蛋白表達水平較正常對照組明顯下調,與透射電鏡觀察結果一致，表明通過透射電鏡觀察細胞連接病理學變化具有較高的可靠性。