應(yīng)曜宇 宋遠(yuǎn)見 胡昕迪 明 福 沈 玉 王玉蘭

(徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 徐州 221004)

大腦由神經(jīng)元組成,而腦細(xì)胞一般是不可再生的,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)隨著時(shí)間的推移而惡化。而目前僅有少數(shù)藥物可以應(yīng)用于此類疾病[1]。淫羊藿素、玉郎傘黃銅等一些化學(xué)物質(zhì)對神經(jīng)的保護(hù)作用和其作用機(jī)制進(jìn)行了研究[2]。同樣,筆者將通過二氫楊梅素(dihydromyricetin, DMY)是否能夠防止腦神經(jīng)退化的研究,進(jìn)一步為治療ND的新藥物提供依據(jù)[3]。近年來,果蠅作為模式生物的優(yōu)勢越來越明顯,除了體積小、繁殖強(qiáng)、價(jià)格低廉外,果蠅的神經(jīng)退行性疾病的表型與人類退行性疾病也有很多的相似之處,果蠅的壽命和爬行能力是顯示果蠅生存狀態(tài)的直觀指標(biāo),由于神經(jīng)退化會(huì)使果蠅運(yùn)動(dòng)行為降低,壽命降低,這種直觀現(xiàn)象可以成為實(shí)驗(yàn)成功與否的依據(jù)[4-5]。并且壽命和爬行能力檢測方法簡單,易操作,因此構(gòu)建此模型可以為人類ND提供新的方法和藥物選擇。本實(shí)驗(yàn)采用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)普通果蠅為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,設(shè)立正常組、ND模型組、加藥組,進(jìn)行分析比較。以期初步探索DMY在神經(jīng)退行性疾病中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

江蘇師范大學(xué)提供的正常黑腹果蠅180只,分為6組,包括正常對照組、ND(Al3+組)、ND+DMY(1mmol/L)、ND+DMY(5mmol/L)、ND+DMY(10mmol/L)、ND+DMY(15mmol/L)。培養(yǎng)正常果蠅若干代后,同時(shí)分別在各個(gè)培養(yǎng)基中加入對應(yīng)材料,收集此代的子代雄果蠅并移入新加藥培養(yǎng)基中用做實(shí)驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基制作

普通玉米培養(yǎng)基(玉米粉8.25g,糖6.2g,水80ml,瓊脂0.62g)加熱攪拌均勻后加0.5ml丙酸倒入高壓蒸汽滅菌后的培養(yǎng)瓶中,每瓶加入0.7g酵母粉。無菌環(huán)境靜止2h后塞上棉塞,貼上標(biāo)簽分組。

1.3 試劑和儀器

硫酸鋁,二氫楊梅素,玉米粉,紅糖,瓊脂,丙酸,酵母,去離子水,無水乙醚,低溫冰箱,果蠅培養(yǎng)箱,高壓滅菌鍋,恒溫水浴箱,電子分析天平,果蠅爬行管。

1.4 ND果蠅模型檢測

通過果蠅爬行和壽命等行為學(xué)的改變來確定模型的成功[4,6]。

1.5 壽命計(jì)時(shí)

為了研究DMY是否會(huì)對神經(jīng)退行性疾病及果蠅的壽命產(chǎn)生影響,收集子代果蠅,每 3d更換新鮮培養(yǎng)基,并記錄果蠅存活數(shù)量,進(jìn)行壽命分析。從收集子代果蠅為第1天開始計(jì)時(shí),每天觀察存活數(shù)量并進(jìn)行記錄。

1.6 爬行計(jì)數(shù)

將年齡為3d的待實(shí)驗(yàn)的果蠅麻醉后放入長度為25cm的爬行管,靜止到果蠅蘇醒后2h,將所有管壁上的果蠅微微震蕩至管底,所有果蠅同時(shí)開始上爬,15s后記錄每一區(qū)間內(nèi)果蠅的數(shù)量。爬行結(jié)果評價(jià)： 從上至下每隔5cm視為1個(gè)區(qū)間,分別為高(high)(20～25cm),偏高(slightly higher)(15～20cm),中等(mid)(10～15cm),偏低(slightly lower)(5～10cm),低(low)(0～5cm)。如正好處于交界線上按高處計(jì)算。同樣方法當(dāng)天進(jìn)行3次，取平均值,每次間隔不少于2h。第7天、第11天采用相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用單因素方差分析比較各組果蠅壽命時(shí)間的差異,期間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度采用Dunnett分析,使用χ2檢驗(yàn)檢測爬行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);使用R×Cχ2檢驗(yàn)分析各組之間分布差異。

2 結(jié)果

2.1 壽命計(jì)時(shí)

壽命實(shí)驗(yàn)果蠅初始樣本量分別為28、29、25、26、27、26只。與正常對照組比較,模型組平均壽命均顯著降低(P<0.01),藥物干預(yù)組果蠅平均壽命也降低(P<0.01);模型組與模型藥物干預(yù)組比較,ND+DMY(1mmol/L)、ND+DMY(5mmol/L)果蠅壽命明顯提高(P<0.05),ND+DMY(10mmol/L)、ND+DMY(15mmol/L)果蠅壽命無明顯變化。結(jié)果說明低濃度DMY對ND所造成的壽命降低具有一定的保護(hù)作用,濃度過高時(shí)則失去效果(表1)。

表1 各組果蠅壽命的比較

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsND group

2.2 爬行計(jì)數(shù)

爬行實(shí)驗(yàn)第3天樣本量分別為45、39、39、45、24、12只。爬行實(shí)驗(yàn)第7天樣本量分別為45、30、33、39、18、12只。爬行實(shí)驗(yàn)第11天樣本量分別為39、15、24、27、9、0只。結(jié)果顯示,隨著年齡的增長,正常對照組變化很小,ND組和高濃度DMY+ND組表現(xiàn)出明顯的攀爬能力減退。低濃度DMY+ND 組果蠅3、7、11d,其爬行能力較正常組無明顯變化。ND組與正常對照組果蠅3、7、11d爬行能力表現(xiàn)出明顯的降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明經(jīng)誘導(dǎo)后的ND果蠅其攀爬能力降低,符合行為能力減退這一行為學(xué)特征。低濃度DMY干預(yù)后的果蠅在3、7、11d均對攀爬能力有一定的改善作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)隨著年齡的不斷增大,差異越來越明顯(第11天ND+DMY(15mmol/L)組果蠅死亡計(jì)數(shù)為0)。綜上,低濃度的DMY對ND運(yùn)動(dòng)能力降低具有一定的抑制作用(圖1、表2)。

圖1 第7天爬行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GroupHighSlightly higherMidSlightly lowerLow3d Normal441000 ND186537 ND+DMY (1mmol/L)*#353100 ND+DMY (5mmol/L)**##432000 ND+DMY (10mmol/L)170223 ND+DMY (15mmol/L)540217d Normal393210 ND1115310 ND+DMY (1mmol/L)*#281004 ND+DMY (5mmol/L)**##363000 ND+DMY (10mmol/L)80028 ND+DMY (15mmol/L)0162311d Normal324011 ND71304 ND+DMY (1mmol/L)*#161700 ND+DMY (5mmol/L)**##233010 ND+DMY (10mmol/L)30420 ND+DMY (15mmol/L)00000

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsND group

測量結(jié)果顯示每天正常對照組爬行能力較強(qiáng)者最多,其次為低濃度加藥組,高濃度加藥組爬行能力急劇降低。

3 討論

以鋁離子誘導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病果蠅實(shí)驗(yàn)在國內(nèi)外已有了很多論證,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了很多對ND具有治療作用的藥物[7]。鋁離子對于人類和大多數(shù)動(dòng)物是一種神經(jīng)毒劑。病理學(xué)上的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,有個(gè)別的ND或者其他神經(jīng)退行性疾病的病理有可能是由于鋁離子的積累造成的。研究顯示,2名患有ND的死者腦內(nèi),尤其是病變部位鋁離子含量異常高。當(dāng)Al3+被注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦后,也發(fā)生了類似的變化。這表明鋁離子對神經(jīng)系統(tǒng)的危害很大。本實(shí)驗(yàn)直接通過鋁離子混于食物中喂養(yǎng)果蠅,研究在鋁離子作用下產(chǎn)生的神經(jīng)退行性疾病的類似癥狀。

本研究應(yīng)用果蠅作為工具,研究了金屬離子鋁與果蠅神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系。用鋁離子喂食果蠅,能夠使果蠅的壽命明顯縮短[8],壽命的縮短是果蠅神經(jīng)退行性疾病的重要特征。本研究結(jié)果表明,在金屬離子鋁的影響下,果蠅的運(yùn)動(dòng)能力隨果蠅年齡的增大而顯著降低。據(jù)此,筆者認(rèn)為,鋁離子確實(shí)能夠誘使果蠅發(fā)生神經(jīng)退行性疾病。與此同時(shí),DMY對于果蠅的保護(hù)作用在此也可以得到體現(xiàn)。隨著DMY濃度的增大,其保護(hù)作用會(huì)不斷增強(qiáng),但超過一定濃度時(shí),其保護(hù)作用呈下降趨勢,類似倒U型,猜測可能與藥物本身的毒性有關(guān)。

本研究雖然以行為學(xué)實(shí)驗(yàn)論證了藥物與疾病的相關(guān)關(guān)系,但由于本次實(shí)驗(yàn)人力,物力,財(cái)力都有限,沒有完整的生化實(shí)驗(yàn)加以佐證,且實(shí)驗(yàn)果蠅的數(shù)量并不是很多。得出更加明確的結(jié)論還有待于更大樣本量和其他不同實(shí)驗(yàn)方法中相關(guān)研究數(shù)據(jù)的支持。