趙雅寧 郭向飛 李建民 趙 旭 徐繼偉 薛承景

(華北理工大學(xué), 1 康復(fù)醫(yī)學(xué)院, 2 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科, 唐山 063000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)在腦血管疾病中大概占10%～15%,其致殘率和死亡率很高[1]。依達(dá)拉奉(Edaravone)是2000年上市的新型氧自由基清除劑,臨床上主要用于治療急性腦梗塞,可有效的防治腦水腫及腦梗塞的進(jìn)展[2]。近年來有學(xué)者將依達(dá)拉奉應(yīng)用于顱腦創(chuàng)傷的治療中,取得了一定效果。自噬對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸、恢復(fù)、修復(fù)、損傷、加重或死亡起著重要作用[3]。SAH早期發(fā)生自噬的激活,抑制自噬可加重SAH神經(jīng)功能[4]。前期研究發(fā)現(xiàn),Edaravone治療可提高 SAH后神經(jīng)元自噬的激活,但其具體作用機(jī)制尚未闡明。自噬的激活涉及多種復(fù)雜的分子機(jī)制,其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路與自噬聯(lián)系最為密切[5]。JNK是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族重要成員之一,現(xiàn)已證實(shí)自噬和JNK信號(hào)活化在多種疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中、神經(jīng)退行性疾病等病理過程中具有關(guān)鍵作用[6-7]。本研究建立SAH動(dòng)物模型,采用依達(dá)拉奉、JNK抑制劑SP600125進(jìn)行干預(yù),觀察海馬區(qū)組織丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平、活化狀態(tài)JNK(磷酸化JNK)、自噬關(guān)鍵因子Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1(輕鏈LC3)-Ⅱ表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞丟失變化,探討JNK對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)及依達(dá)拉奉的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制作

清潔級(jí)雄性SD大鼠160只,體質(zhì)量350～450g(購(gòu)置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào)SCXK(京)2009-003)。分為假手術(shù)組(Sham組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組(SAH組)、JNK抑制劑SP600125組、依達(dá)拉奉干預(yù)組。每組分為6、24、48h和72h 4個(gè)時(shí)間亞組。

采用經(jīng)典的自體血2次枕大池注血法(間隔48h分別向枕大池注射自體動(dòng)脈血0.3ml)制備大鼠SAH的模型[8]。Sham組向枕大池2次注入0.3ml生理鹽水,余操作均與SAH組一致。

SP600125組： 模型制備前30min側(cè)腦室注射SP600125試劑(美國(guó)SANTACRUZ公司,貨號(hào)： HY-12041-04752-2013),10μg/μl,注射速度為1mm/min,留針10min后,以1mm/min速度取針。依達(dá)拉奉干預(yù)組： 在模型制備后即刻經(jīng)尾靜脈注射依達(dá)拉奉(國(guó)藥準(zhǔn)字H20110090,建天泉藥業(yè)股份有限公司),10mg/kg,每24h注射給藥1次,至72h結(jié)束。

模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)： (1) 當(dāng)行2次枕大池注血時(shí),可見少量血性腦脊液在穿刺部位滲出,此現(xiàn)象充分說明穿刺針位置準(zhǔn)確;(2) 剝離腦部時(shí)肉眼明顯可見血性液體散在分布在腦底基底池部位。模型制作過程中,SAH組、SP600125組和依達(dá)拉奉組因死亡或不符合標(biāo)準(zhǔn)被剔除的動(dòng)物分別為7、8、8只。上述被剔除動(dòng)物依次補(bǔ)齊,最終各組40只動(dòng)物納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2 腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

每組各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠,常規(guī)麻醉后,處死動(dòng)物,用4%多聚甲醛灌注固定后,取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。石蠟包埋、冠狀切片,片厚5μm,H-E染色。光學(xué)顯微鏡下觀察;在400×光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化,計(jì)數(shù)該視野下的存活神經(jīng)元數(shù)量(有明顯細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁為存活神經(jīng)細(xì)胞)。具體方法： 各組各時(shí)間點(diǎn)5只大鼠,每只大鼠取4張海馬區(qū)切片,每張切片選取5個(gè)不重復(fù)的視野(共100個(gè)視野),選Motic-6.0圖像采集以及系統(tǒng)分析,以每個(gè)視野下平均細(xì)胞百分率(400×)下CA1區(qū)存活細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值%)表示。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)

標(biāo)本采集同H-E染色,切片常規(guī)脫蠟至去離子水、滴加復(fù)合消化液、加入37℃溫箱孵育20min, PBS洗滌3次,每次5min,用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15min, PBS洗滌、滴加兔抗鼠磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶200,1∶200,1∶250),4℃過夜;37℃復(fù)溫45min,PBS洗滌、滴加生物素化二抗,37℃孵育40min,PBS洗滌,DAB顯色,蘇木精輕度復(fù)染、脫水透明、封片。鏡下觀察并攝片。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)磷酸化JNK、 Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)

各組各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠,按照規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后,快速斷頭取腦,用冰箱中預(yù)冷的器械在冰上分離出雙側(cè)海馬組織,稱量0.6g,加入1 ml RNAiso Plus溶液后勻漿,室溫靜置5min后12000r/min 4℃離心5min,取上清移至新的1.5ml離心管內(nèi),加入1/5 RNAiso Plus溶液體積的氯仿,震蕩混勻后室溫靜置5min,12000r/min 4℃離心15min,將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中,加入0.5～1倍RNA iso Plus溶液體積的異丙醇,室溫靜置10min,12000r/min 4℃離心10min,棄掉上清液,用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀,7500r/min 4℃離心5min,棄上清保留沉淀,干燥(不可加熱),溶解于30μl DEPC處理水中,測(cè)量OD260/280值,根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度,-80℃保存。

檢測(cè)步驟： (1) 磷酸化JNK,上游引物AGGGAG CACACAATAGAGGAGTG,下游引物GAAGACGA CGGATGCTGAGAG;(2) Beclin-1,上游引物CTCT CGTCAAGGCGTCACTTC,下游引物CCTTAGAC CCCTCCATTCCTCA;(3) LC3,上游引物ACCCTCT ACGATGCTGGTGA,下游引物GCTGTCCTCAATG TCCTTCTG。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)： 42℃ 50min,95℃ 10s;(95℃ 15s、56℃ 20s)×45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因,以Sham組磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA 和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)為1,計(jì)算各組磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA 和LC3-Ⅱ mRNA 的Ct值(公式(△△Ct=目的基因平均△Ct值-管家基因平均Ct值,△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct,相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct)。

1.5 MDA含量測(cè)定

取材方法同免疫印跡,大鼠致死后,迅速取雙側(cè)皮質(zhì)及海馬區(qū)組織,稱量0.6g,勻漿,依次加入試劑,混勻器混勻,沸水浴40min,冷卻,然后3500r/min,離心10min。取上清,532nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,比色測(cè)定各管吸光度值,按說明計(jì)算MDA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化

Sham組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、排列整齊、胞核大而圓,核仁清晰;SAH組海馬區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞變性水腫、壞死神經(jīng)細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)核溶解、核碎裂或核消失結(jié)構(gòu)不清。與Sham組比較,SAH組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞存活率均明顯減少(P<0.05);SP600125組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步減輕,視野中存活神經(jīng)細(xì)胞增多,與SAH組比較,各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元存活率均明顯增加(P<0.05);依達(dá)拉奉組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均減輕,視野中死亡神經(jīng)細(xì)胞減少,與SAH組比較,依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元存活率均明顯增多;依達(dá)拉奉組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活率高于SP600125組(P<0.05)(圖1,表1)。

表1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活率比較(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

2.2 MDA檢測(cè)

與 Sham組比較,SAH組各時(shí)間點(diǎn)MDA均明顯增多(P<0.05);與SAH組比較,SP600125組各時(shí)間點(diǎn)MDA均降低(P<0.05);與SAH組比較,依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)MDA均降低(P<0.05);依達(dá)拉奉組MDA低于SP600125組(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)MDA水平比較(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

2.3 磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學(xué)顯色

磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核。Sham組大鼠大腦海馬區(qū)有極少量的陽(yáng)性細(xì)胞,染色較淡。與Sham組比較,SAH 組各磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng),染色棕黃;與SAH 組比較,SP600125組磷酸化JNK免疫陽(yáng)性反應(yīng)減弱,染色變淺,Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)。與SAH 組比較,依達(dá)拉奉組磷酸化JNK免疫陽(yáng)性反應(yīng)減弱,染色變淺,Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)(圖2,表3～5)。

表3 各組大鼠海馬區(qū)磷酸化JNK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n=5,±s,個(gè)/高倍鏡視野)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表4 各組大鼠海馬區(qū)Beclin-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n=5,±s,個(gè)/高倍鏡視野)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表5 各組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n=5,±s,個(gè)/高倍鏡視野)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化，H-E染色,×400。A： Sham組72h;B： SAH組72h;C： SAH組72h;D： 依達(dá)拉奉組72h.

圖2 各組大鼠海馬區(qū)JNK(A1～D1)、Beclin-1(A2～D2)和LC3-Ⅱ(A3～D3)表達(dá)情況，免疫組織化學(xué),×400。A： 假手術(shù)組；B： SAH組；C： SP600125組；D： 依達(dá)拉奉組.

Fig 1 The morphological changes of neurons in hippocampus in each group， H-E staining, ×400. A： Sham group 72h; B： SAH group 72h; C： SP600125 group 72h; D： Edaravone group 72h.

Fig 2 The expression of JNK (A1-D1), Beclin-1 (A2-D2) and LC3-Ⅱ (A3-D3) in the hippocampal neurons among each group， Immunohistochemistry, ×400. A： Sham group; B： SAH group; C： SP600125 group; D： Edaravone group.

2.4 磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR

與Sham組比較,SAH 組各磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);與SAH 組比較,SP600125組磷酸化JNK mRNA表達(dá)水平降低,Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)(P<0.05);與SAH 組比較,依達(dá)拉奉組磷酸化JNK mRNA表達(dá)水平降低,Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)(P<0.05); 依達(dá)拉奉組和SP600125組間磷酸化JNK mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表6～8)。

表6 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元磷酸化JNK mRNA表達(dá)水平(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表7 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元Beclin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

表8 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元LC3-Ⅱ mRNA相對(duì)表達(dá)水平(n=5,±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsSAH

3 討論

本研究結(jié)果顯示依達(dá)拉奉可減輕SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失,改善動(dòng)物行為學(xué)障礙,說明依達(dá)拉奉對(duì)SAH大鼠有較好的保護(hù)作用。SAH后存在氧自由基連鎖反應(yīng),這種氧自由基連鎖反應(yīng)不僅是SAH早期神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵[9],同時(shí)加重了SAH遲發(fā)性血管痙攣;氧化應(yīng)激水平與SAH損傷程度呈正相關(guān)[10],因此給予具有較強(qiáng)抗氧化、清除自由基作用的依達(dá)拉奉對(duì)SAH誘導(dǎo)神經(jīng)損傷有較好保護(hù)作用。

JNK信號(hào)被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要通路。研究顯示SAH早期JNK即可激活,激活的JNK不僅介導(dǎo)SAH早期神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體通路,且與SAH后遲發(fā)性血管痙攣密切相關(guān)[11]。SAH模型中,應(yīng)用JNK抑制劑可減少大鼠腦內(nèi)caspase-3、caspase-8以及細(xì)胞色素C等凋亡因子的表達(dá)水平,且大鼠血腦屏障破壞和腦水腫有很大程度的緩解[12]。自噬是指細(xì)胞通過溶酶體途徑對(duì)功能受損的白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行識(shí)別、降解和修復(fù)的現(xiàn)象,在細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激時(shí)的生存機(jī)制中起決定性作用。研究顯示腦損傷狀態(tài)下,自噬具有“雙刃劍”作用,適度自噬激活能夠清除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器,調(diào)節(jié)能量代謝,減輕細(xì)胞損傷程度,降低神經(jīng)細(xì)胞死亡的發(fā)生率;但過度的自噬可以促進(jìn)caspase-3裂解,加重神經(jīng)細(xì)胞死亡[13]。Zhao等[14]通過改良的顱內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤進(jìn)行預(yù)處理,顯示腦組織含水量和血腦屏障滲透率進(jìn)一步加劇及神經(jīng)細(xì)胞凋亡,神經(jīng)功能評(píng)分下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示JNK抑制劑SP600125組,死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯降低,Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增高,說明JNK激活參與SAH后自噬的調(diào)節(jié)。Yan等[15]在糖尿病GK大鼠模型研究中表明,JNK信號(hào)通路可以通過介導(dǎo)P53的磷酸化而達(dá)到調(diào)控自噬的目的。Li等[16]研究顯示硼替佐米可以通過促進(jìn)自噬而起到對(duì)頭頸部鱗癌的治療作用。本研究依達(dá)拉奉組磷酸化JNK表達(dá)減少, Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)增加,依達(dá)拉奉可抑制JNK通路激活,提高神經(jīng)元自噬水平,對(duì)SAH具有神經(jīng)保護(hù)作用。值得注意的是,本研究依達(dá)拉奉組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活率顯著高于SP600125組,而兩組間磷酸化JNK、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平無明顯差異,提示依達(dá)拉奉的神經(jīng)保護(hù)作用不完全依賴JNK-自噬途徑。依達(dá)拉奉是目前氧自由基清除能力最為強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)劑,研究證實(shí)依達(dá)拉奉可調(diào)整線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,有效拮抗腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞丟失,促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)[17]。

綜上所述,本研究結(jié)果表明JNK的活化可降低SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平,依達(dá)拉奉可抑制JNK活化,提高SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平,減輕SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果為依達(dá)拉奉在顱腦損傷救治的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。